[发明专利]一种微量蛋白免疫印迹检测方法

说明书

本发明具体涉及一种微量蛋白免疫印迹检测方法，属于蛋白检测领域，本发明在传统蛋白免疫印迹检测方法上进行改进，以上样缓冲液直接裂解细胞，避免了传统以裂解液裂解细胞过程中蛋白的丢失，并调整制胶梳孔径为1.0‑1.5mm，增强了检测信号，克服了现有蛋白质免疫印迹技术要求蛋白供体细胞总量＞10⁶个的缺陷，可用于检测少量细胞蛋白的表达，有效提高了免疫印迹的检测范围。

技术领域

本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种微量蛋白免疫印迹检测方法。

背景技术

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白质印迹法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。现有的蛋白质免疫印迹技术，对提取总蛋白的细胞量要求较高，一般需要＞10⁶个细胞才能够提取足够的蛋白用于后续检测。在现实的实验过程中，很多实验无妨采集足够的细胞量，导致蛋白质免疫印迹实验无法进行，阻碍了科学研究的开展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微量蛋白免疫印迹检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种微量蛋白免疫印迹检测方法，所述检测方法为，

(1)收集待测细胞，调整细胞个数为500-20000个，加入体积比为1000:1:1的上样缓冲液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液裂解细胞，得到细胞裂解液；

(2)向细胞裂解液中加入等体积上样缓冲液，混匀后煮沸，得到上样蛋白溶液；

(3)配置电泳凝胶，将凝胶倒入制胶板后，插入制孔梳，待胶凝固后取出制孔梳，形成上样孔，所述上样孔的宽为1.0-1.5mm；

(4)将(2)中的上样蛋白溶液加入上样孔中，进行电泳；

(5)再进行转模、抗体孵育，最后用ECL试剂进行检测。

作为优选技术方案之一，步骤(2)中所述裂解液为蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液。

作为优选技术方案之一，步骤(3)中所述凝胶为SDS-PAGE电泳凝胶。

作为优选技术方案之一，所述SDS-PAGE电泳凝胶包括5％的浓缩胶和10％分离胶。

作为优选技术方案之一，步骤(3)中所述电泳条件为先100V电泳15min，再150V至指示剂电泳到底部。

本发明的有益效果在于：

本发明以上样缓冲液直接裂解细胞，避免了传统的裂解液裂解细胞过程中蛋白的丢失，也克服了细胞计数不准带来的误差；通过限定上样孔的宽为1.0-1.5mm，增强了检测信号，克服了现有蛋白质免疫印迹技术要求蛋白供体细胞总量＞10⁶个的缺陷，使得少量细胞(几千到几万个)也可用蛋白质免疫印迹技术检测目的蛋白表达情况，大大提高了蛋白质免疫印迹技术的应用范围，有利于基础研究的开展。

附图说明

图1为检测不同数量造血干细胞和造血祖细胞群中的actin，1、2为3mm上样孔检测造血祖细胞，3为标准蛋白，4-6为1.5mm上样孔检测造血祖细胞，7-9为1.5mm上样孔检测造血干细胞；