[发明专利]一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法

权利要求书

1.一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：药品的选择

(1)酶及试剂盒：KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加A酶、T4DNA Ligase、Green Realtime PCR qRT-PCR荧光定量酶、Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTM RTase RNA反转录试剂盒、DNAMarkerIII和GelStain EB替代物、RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态菌体、限制性内切酶EcoRI和XbaI；

(2)其他药品：琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、氨苄青霉素、棉子糖、半乳糖、酵母缺陷型培养基SD-Ura；

(3)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L，LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；

(4)酵母筛选固体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，琼脂粉20g，葡萄糖20g；

(5)酵母扩增液体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，葡萄糖20g；

(6)酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，半乳糖20g，棉子糖10g；

(7)主要仪器：PCR扩增仪、高速离心机、电泳设备、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪、真空冷冻干燥仪、气相色谱仪；

步骤二：GhHSD1的电子克隆

将拟南芥的HSD1(AT5G50700.1)基因在测序得到的陆地棉(G.hirsutum,AD1)基因组数据(JGI)的gff3文件数据库中进行同源比对、搜索，找到相应目的序列后，采用Oligo 6软件设计引物，采用PCR技术从中棉所36中扩增出完整CDS序列1053bp，其中开放阅读框ORF为1053bp，编码350个氨基酸残基；

步骤三：克隆基因的过程

(1)试验材料中棉所36种植于中国农业科学院棉花研究所试验地的，按一般大田管理，所取部位有根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用，植物DNA提取采用改良的CTAB法，植物总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒；

(2)将200ng RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释4倍作为PCR反应模板；以提取的各时期棉花胚珠总RNA为模板，利用的是TaKaRa的反转录试剂盒将其反转录为cDNA；

(3)进行PCR反应扩增目的基因采用Oligo6软件设计GhHSD1的引物，以反转录所得到的混合cDNA为模板对棉花GhHSD1基因进行PCR扩增；

引物序列：

GhHSD1-F:5′-ATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′

GhHSD1-R:5′-TTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGAT-3′

(4)反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果；

(5)对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收；

(6)将(5)中胶回收的产物连接PMD18-T载体并转化大肠杆菌；

(7)37℃过夜培养从抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600ul LB培养基中37℃摇菌培养4h；

(8)菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序；

步骤四：pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建

(1)质粒提取及酶切

质粒提取采用质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为180ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用EcoRI-XbaI进行双酶切；

(2)pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建

目的基因ORF序列扩增：根据终载体pYES2的图谱设计EcoRI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列如下：

In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′(含酶切位点EcoRI)

In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′(含酶切位点XbaI)

使用高保真酶扩增得到目的片段；

PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min；

电泳检测与回收：PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳1h，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带，用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行；

融合表达载体构建：

a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；

b.16℃连接2h；

c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。

连接产物的转化

a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)；

c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e.吸500μL不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；

f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；

g.37℃恒温培养箱中培养16～20h；

h.随机挑取单克隆进行PCR验证结果；

所用引物序列为：

In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′

In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′

i.对5号单克隆在含有Amp的LB培养基进行50ml扩繁，37℃条件下190rpm的摇床过夜，采用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒备用；

步骤五：转化酿酒酵母INVSc1

酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)配制如下：

(1)称取SD-Ura 8g，Agar 20g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；

(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖；

(3)在超净工作台内将培养基倒入无菌培养皿中，凝固后备用；

利用INVSc1感受态细胞进行转化，具体过程如下：

(1)取100μl冰上融化的酿酒酵母INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg、Carrier DNA95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min，15min时翻转6-8次混匀；

(2)将管放42℃水浴15min，7.5min时翻转6-8次混匀；

(3)5000rpm离心40s，弃上清，ddH₂O 400μl重悬，离心30s，弃上清；

(4)ddH₂O 50μl重悬，涂于酿酒酵母菌体繁殖平板固体培养基SD-Ura，29℃培养48-96h；

(5)同时按照上述方法将没有酶切的pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到转空载体酵母；

步骤六：转基因酵母阳性株的鉴定及诱导表达

酵母扩增液体培养基SD-Ura配制见如下：

(1)称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；

(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖，备用；

酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura配制见如下：

(1)称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；

(2)待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：20％的半乳糖100ml，10％的棉子糖100ml，备用；

酵母单克隆鉴定

(1)挑取酵母克隆，在盛有1ml的扩增液体培养基SD-Ura中29℃，300rpm/min过夜培养；

(2)对转基因酵母进行PCR鉴定。用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约1057bp的条带，说明GhHSD1基因已整合到酵母基因组中；

(3)对转空载体酵母进行PCR鉴定，用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约155bp的条带，说明pYES2空载体已整合到酵母基因组中；

转GhHSD1酵母的诱导表达

(1)随机选取3个转GhHSD1阳性酵母菌株(200μl菌液)分别接种至含30ml扩增液体培养基SD-Ura的200ml无菌三角瓶。在摇床中30℃、300rpm/min摇床生长至OD600＝30-35(约48h)。

(2)室温5000rpm离心5min收集沉淀物，弃除上清，用60ml蛋白诱导培养基SD-Ura重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养48h，5000g离心1min，收集菌体沉淀。

(3)放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥；

步骤七：酵母RNA的提取以及qRT-PCR验证基因表达

(1)用酵母RNA提取试剂盒提取步骤六中诱导表达后的酵母菌体沉淀的总RNA，用全式金反转录试剂盒合成cDNA，用全式金荧光定量试剂盒进行qRT-PCR验证。

(2)同时按照上述方法将pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1的对照菌株进行培养和RNA提取和qRT-PCR检测。

qRT-PCR反应体系为：2×TransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μl、ForwardPrimer(10μM)0.4μl、Reverse Primer(10μM)0.4μl、Passive Reference Dye(50×)0.4μl、Template cDNA 2μl、RNase-Free Water up to 20μl。

qRT-PCR反应程序：预变性94℃(30s)；变性94℃(5s)，退火58℃(15s)，延伸72℃(12s)，45个循环。

融解曲线分析：95℃(15s)，60℃(1min)，95℃(15s)，10℃(2min)。

荧光定量引物序列：

RT-GhHSD1F：CGACTTGTTGAGGAAACCGTGAA

RT-GhHSD1R：GCATTGTAGACGCTTGTTCTTGG

RT-18SF：TTAGTTGGTGGAGTGATTTG

RT-18SR：GGTGGCTCTGTCAGTGTAG

步骤八：转基因酵母的脂肪及脂肪酸成分含量测定

转GhHSD1酵母总脂肪含量测定

用气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的总脂肪含量进行测定；

转GhHSD1酵母脂肪酸组分测定

用气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的脂肪酸各组分含量进行测定。