[发明专利]一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法

说明书

本发明公开了一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，在酿酒酵母中异源表达GhHSD1基因，随机挑选3个阳性克隆进行24h诱导培养，用气相色谱法对诱导培养24h后的酵母菌体进行总脂肪含量和脂肪酸各组分含量的测定，发现3个转GhHSD1酵母阳性株系与野生型酵母菌株相比总脂肪含量、肉豆蔻酸（C14:0）含量、棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1）含量均有所提高。

技术领域

本发明涉及棉花基因克隆方法技术领域，具体是指一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，并且是我国的五大油料作物之一，剥壳后的棉籽仁含油量约15％-40％(王彦霞等，2011)。棉籽含有的脂肪酸由26％的棕榈酸、2％的硬脂酸、15％的油酸和55％的亚油酸等组成。脂肪酸能提供种子萌发所需要的能量，同时也是某些信号分子的前体,在损伤防御和耐寒性等方面有重要作用(卢善发，2000)。此外,精炼后的棉籽具有较高的营养价值，含有人体所必需的脂肪酸，其中亚油酸的含量最高，占有50％以上，所以比动物油更健康(邱新棉，1999)。同时棉籽油含有多种饱和脂肪酸，可以用作起酥油和人造奶油等(杜玮，2005)。

棉籽油作为食用油，不仅有利于健康，还能增加食物风味，与花生油和芝麻油相比，有较好的热稳定性(沈端庄等，1987)。在工业上，棉籽油被用来生产油墨、甘油、肥皂等(陈金思等，2010)。棉籽油是优质的生物柴油原料(唐凤仙等，2010)，利用棉籽油生产生物柴油，能够有效缓解石油能源供需紧张的问题，从而有利于发展和应用循环经济。

油体固醇蛋白是油体中发现的一种微量蛋白，它与哺乳动物中羟基类固醇脱氢酶家族序列的相似性极高，因此也被称为羟基类固醇脱氢酶(HSD)。芝麻中的Sop2是植物中第一个被发现的HSD基因(Lin et al.,2002)。蛋白检测实验发现Sop2存在于向日葵、大豆和油菜种子的油体中(Lin et al.,2002)。研究发现在拟南芥中，AtHSD1主要是在种子中表达，随着种子发育成熟，AtHSD1的表达量急速上升，到了种子成熟后期开始下降(Baud etal.,2009)。过量表达AtHSD1的转基因拟南芥与野生型植株相比茎杆变粗，分枝变多，荚果数增多，对油菜素甾醇更敏感(Li et al.,2007)。过表达AtHSD1的转基因油菜同样出现茎秆变粗，花序变多的现象(Li et al.,2007)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，在酿酒酵母中异源表达GhHSD1基因，随机挑选3个阳性克隆进行24h诱导培养，用气相色谱法对诱导培养24h后的酵母菌体进行总脂肪含量和脂肪酸各组分含量的测定，发现三个转GhHSD1酵母阳性株系与野生型酵母菌株相比总脂肪含量、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)含量均有所提高。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，包括以下步骤：

步骤一：药品的选择

(1)酶及试剂盒：KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加A酶、T4 DNA Ligase、Green Realtime PCR qRT-PCR荧光定量酶、Gel ExtractionKit胶回收试剂盒、DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTM RTaseRNA反转录试剂盒、DNAMarkerIII和GelStain EB替代物、RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态菌体、限制性内切酶EcoRI和XbaI；

(2)其他药品：琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、氨苄青霉素、棉子糖、半乳糖、酵母缺陷型培养基SD-Ura；