[发明专利]一种密码子优化的COL7A1基因及慢病毒和应用

权利要求书

1.一种用于感染人表皮干细胞的携带密码子优化的COL7A1基因的慢病毒载体质粒，其特征在于，其包括：含有EFS启动子的慢病毒载体基因组和用于编码的密码子优化COL7A1基因序列；其中，含有EFS启动子的慢病毒载体基因组序列如SEQ ID No:3所示；密码子优化COL7A1基因序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的密码子优化的COL7A1基因慢病毒载体质粒的构建方法，该方法为：将编码密码子优化的COL7A1基因片段亚克隆至pCCL-EFS质粒中，得到pCCL-EFS-COL7A1-OPT质粒；包括如下步骤：

(1)将pCCL-EFS质粒用限制性内切酶EcoRI和SalI于于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-EFS载体片段；

将编码密码子优化的COL7A1基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/SalI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和SalI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收密码子优化的COL7A1基因片段；

(2)将胶回收试剂盒回收的pCCL-EFS载体片段和密码子优化的COL7A1基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；

(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；

(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-EFS-COL7A1-OPT质粒，以EcoRI和SalI双酶切初步鉴定后进行DNA测序鉴定，至此慢病毒表达载体质粒构建成功。

3.一种用于感染人表皮干细胞的携带密码子优化的COL7A1基因的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包含Lentivirus衣壳、包装在衣壳中的Lentivirus基因组、EFS启动子和编码密码子优化的COL7A1基因序列；所述密码子优化的COL7A1基因序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.一种权利要求3所述的携带密码子优化的COL7A1基因的慢病毒的制备方法，该制备方法包括包装方法和纯化方法，其中包装过程如下：

将载体质粒pCCL-EFS-COL7A1-OPT、和包装质粒psPAX2与pMD2.G，共转染293T细胞，转染后收取培养基上清液用于纯化；

其中，纯化过程如下：

纯化采用GE的AKTAavant层析系统，采用DEAE层析，切向流过滤和core700层析纯化工艺，纯化得GFP假病毒，具体纯化过程如下：

(1)澄清:病毒收获液经过滤的处理，以除去不溶性微粒，提高溶液的澄清度，以便后续的层析纯化处理；

(2)核酸酶消化：用25U/ml的Benzonase于37±1℃处理50-70min，去除核酸污染物；或将步骤(1)的澄清液浓缩以后，再进行本步骤，以降低消化酶的使用成本和提高核酸的去除率；

(3)阴离子交换层析：采用整体柱CIM DEAE，进行阴离子交换层析，以去除蛋白和DNA污染物；

(4)浓缩换液：阴离子交换层析的洗脱液采用截留分子量500kDa的膜做切相流过滤，进行浓缩换液以去除小分子杂质；

(5)分子排阻层析：采用Core 700层析填料，将大于700kDa的含有病毒的粒子经外水体积排出得到分子排阻层析的纯化液，而分子量更小的杂质则进入填料的孔内被吸附于其中；

(6)保存：将分子排阻层析的纯化液，采用孔径小于0.5um的膜过滤，得到密码子优化的COL7A1基因的慢病毒，于-80℃保存。