[发明专利]一种密码子优化的COL7A1基因及慢病毒和应用

说明书

本发明涉及一种密码子优化的COL7A1基因序列，该基因序列是与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。Western Blot检测结果显示：密码子优化COL7A1基因表达水平明显高于野生型COL7A1基因。携带密码子优化COL7A1基因的慢病毒感染人表皮干细胞后，能成功地在体外培养形成表皮片。因此，携带密码子优化COL7A1基因的慢病毒可作为RDEB基因治疗药物，可用于建立结合LV和表皮干细胞二者优势的RDEB临床治疗产品。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种密码子优化的COL7A1基因及慢病毒和应用。

背景技术

人类皮肤由表皮(epidermis)、真皮(dermis)、皮下组织和皮肤附属器构成。基底膜带(basement membrane zone,BMZ)位于表皮和真皮之间，是表皮与真皮之间的连接结构。遗传性大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa,EB)是由于BMZ的结构异常而引起的、以表皮和真皮之间出现水疱和血疱为特征的单基因遗传病，可分为四大类：单纯性大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa simplex,EBS)；交界型大疱性表皮松解症(junctional epidermolysis bullosa，JEB)；营养不良型大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysis bullosa，DEB)；Kindler综合征。国际上不同国家和地区的流行病学调查显示EB患病率在10万分之2-5，据此推算我国患病人数约在3-7万，全球患病人数可能在20-40万级别，其中40％以上是隐性营养不良型大疱性表皮松解症(recessive dystrophicepidermolysis bullosa,RDEB)。RDEB患者临床表现差异较大，包括仅累及手脚皮肤到伤及内脏粘膜以及角膜，甚至危及患者生命。目前为止还没有有效治疗手段，通常采取对症和支持治疗。细胞治疗、蛋白替代治疗和基因治疗都在进行尝试。其中基于表皮干细胞(epidermal stem cells,EpSCs)的基因治疗有望成为EB的有效治疗措施。国际上EB的基因治疗临床试验主要聚焦到JEB和RDEB。

RDEB(隐性营养不良型)是由VII型胶原COL7A1基因突变造成。COL7A1胶原是锚原纤维(anchoring fibrils,AFs)的主要组份，AFs在维持表皮和真皮之间的连接起到至关重要的作用，因此，COL7A1基因突变导致表皮与真皮之间结构稳态丧失。人COL7A1基因座全长32kb，位于三号染色体3p21，由118个外显子构成，mRNA转录本约8.9kb，编码含有2944个氨基酸的蛋白。目前COL7A1基因已报道700多个突变，大部分呈隐性遗传，小部分表现为显性遗传。

表皮干细胞(epidermal stem cells,EpSCs)位于表皮的基底层，负责维持表皮的周期性角化过程。表皮干细胞的体外培养扩增和克隆分析方法是哈佛医学院的HowardGreen及其团队上世纪70-80年代建立的，用于评估EpSCs在体外的干性(stemness)和生长潜能。EpSCs在体内能够重建完整表皮，在体外表现为完全克隆(holoclone)生长方式。婴幼儿表皮细胞以EpSCs为主，体外呈现为完全克隆，老年人的EpSCs的比例很低，体外多呈现为部分克隆(meroclone)和终末克隆(paraclone)。单个表皮干细胞在体外扩增的子代细胞能够满足大面积烧伤病人的表皮重建，也已在累及EpSCs的单基因遗传病如EB的基因治疗中显示出了强大的作用。

RDEB可以通过间接体内(ex vivo)的方式进行治疗，也就是获取患者的EpSCs，体外扩增，通过基因转移技术补偿表达正常的COL7A1基因，在体外培养成表皮的皮瓣，移植到患病部位，持续恢复患者的皮肤结构，实现长期治愈。该策略有几个优势：1)自体细胞，无免疫原性；2)EpSCs可大量体外扩增且能维持干性，理论上一个EpSCs的子代细胞可满足全身治疗；3)外源基因整合位点可明确定位，基因转移造成的基因组毒性降到最低；4)局部表皮治疗，风险低；5)成药形式是携带正常基因的慢病毒载体质粒，可规模化生产，用于所有RDEB患者。