[发明专利]一种CRISPR SpCas9(K510A)突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR SpCas9(K510A)突变体及其应用，该SpCas9突变体将野生型SpCas9的第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基设计得到的，其中，所述野生型SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SpCas9突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该SpCas9(K510A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种CRISPR SpCas9(K510A)突变体及其应用。

背景技术

SpCas9(SpCas9)在基因编辑中应用广泛。SpCas9基因编辑系统包括SpCas9蛋白和sgRNA。SpCas9蛋白和sgRNA结合形成复合物，该复合物通过SpCas9上的与PAM相互作用结构域和sgRNA上的向导序列(guide sequence)序列特异性识别靶位点，并利用HNH结构域和RuvC结构域对靶标DNA进行双链平端剪切。在活体细胞中，剪切后的基因组DNA可以启动NHEJ进行修复，从而产生插入/缺失突变(Indel)。

但在相关技术中，野生型SpCas9虽然可以高效的对基因进行编辑，却在编辑靶位点的同时也对一些与靶位点类似的非靶位点进行编辑，这严重影响了SpCas9的临床应用。

因此，亟待开发一种新型SpCas9。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种SpCas9突变体或其活性片段，相比于常规的野生型SpCas9，在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

本发明还提出一种提供编码上述SpCas9突变体或其活性片段的基因。

本发明还提出一种组合物。

本发明还提出一种多核苷酸。

本发明还提出一种向导多核苷酸/Cas复合物。

本发明还提出含有上述基因的重组载体、重组菌或细胞。

本发明还提出一种修饰细胞基因组中的靶位点的方法。

本发明还提出上述SpCas9突变体或其活性片段或上述基因在基因编辑中的应用。

根据本发明的第一个方面，提供一种SpCas9突变体或其活性片段，该SpCas9突变体或其活性片段包括：与SEQ ID NO.1所示的野生型SpCas9多肽具有至少90％的氨基酸同一性，且野生型SpCas9多肽的REC3结构域的第510位氨基酸残基突变为丙氨酸残基，其中，该SpCas9突变体具有内切核酸酶活性。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明中的SpCas9(K510A)突变体，是将野生型SpCas9(SEQ ID NO.1)的第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基设计得到的。发明人分析野生型SpCas9 REC3结构域的氨基酸残基与sgRNA/靶DNA杂合双链的相互作用，发现REC3结构中的部分氨基酸残基与sgRNA/靶DNA双链形成了非特异性的氢键相互作用，通过进一步对于相互作用力类型、大小及结构的筛选后，得到了REC3结构中的第510位的亲水性氨基酸残基赖氨酸残基(Lysine residue)为最佳突变点。通过将将野生型SpCas9 REC3结构域第510位的赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，在反复验证证实SpCas9(K510A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

其中，上述SEQ ID NO.1所示野生型SpCas9的氨基酸序列为：