[发明专利]DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法

权利要求书

1.DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）通过慢病毒载体将GPC3-ODC422-461基因序列转入iPS；

（2）慢病毒生产通过转染293T-17细胞产生慢病毒颗粒；转染后36和60小时收获病毒，并在23,000r.p.m通过超速离心浓缩；在4°C下放置2h15min；

（3）感染培养基为补充有Polybrene的EHT培养基（8微克ml-1，Sigma）；慢病毒感染总量为250μl（24孔板）；iPS在旋转接种过程中很容易受到损害，因此感染是静置12h，然后向其中添加250μl新鲜EHT培养基稀聚乙烯；

（4）将平行孔再培养3天以进行测量细胞百分比的感染效率，实现感染效率的30–70％。

2.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述转移至细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2孵箱中孵育2小时；弃去上层未贴壁的淋巴细胞，用预温至37℃的PBS将残余液体洗去,在培养瓶中加入含有IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)和10%小牛血清的RPMI1640培养液,每3天半量换液。

3.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述培养24及48小时后收获未转染细胞及转染pIRES-EGFP的细胞，预冷的PBS洗细胞一次，分别加入检测抗体后冰上孵育30分钟，PBS洗去未结合抗体后重悬细胞，通过流式细胞术分析细胞CD11c、CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达水平。

4.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述通过流氏细胞术分析细胞CD69的表达水平，利用qPCR测定IFN-γ分泌表达情况测定T细胞激活。

5.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述TNF-a，IL-1b和IL-6均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导生，这3种细胞因子均可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达。

6.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述使细胞内MHCII类分子区室消失,能够上调细胞表面MHC类II类分子和B7家族分子的表达，使未成熟DC分化为成熟DC，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱,而抗原递呈能力显菩塔强，可极强地激活T细胞。

7.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述TNF-a/IL-1b/L-6三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导DC的完全成熟，从而制备出可以应用于临床的DC。

8.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述在TNF-a/L-1b/L-6 成熟诱导组合中添加PGE2，可进一步提高DC的产量、成熟度、迁移能力和兔疫激活能力，这里尤为重要的是DC迁移能力的提高。

9.根据权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其特征在于：所述TNF-1L-1/L-6诱导成熟的DC迁移能力较弱，不能很好地到达淋巴结而激活T细胞；而添加PGE2后诱导成熟的DC因表面趋化因子受体的高表达，而更容易迁移至淋巴结，而引起机体对抗肿瘤的免疫反应。