[发明专利]一种成肌细胞永生化的方法在审
| 申请号： | 202011589588.0 | 申请日： | 2020-12-28 |
| 公开（公告）号： | CN112646782A | 公开（公告）日： | 2021-04-13 |
| 发明（设计）人： | 达琦;李恬婧;刘洁;陶米林;喻小鲁 | 申请（专利权）人： | 广东赤萌医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 孙凤侠 |
| 地址： | 510700 广东省广州市黄埔区高*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 细胞 永生 方法 | ||
1.一种成肌细胞永生化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.细胞准备：
将肌肉样本分离得到的细胞用培养基重悬后铺细胞培养容器培养；
S2.病毒感染：
S21.一轮感染：吸除细胞培养容器中的上清，加入病毒液后进行离心，然后继续培养；
S22.依次重复S21多次，进行多轮感染；
S3.抗性筛选：
取出步骤S2培养后的细胞培养容器，进行抗性筛选，筛选后继续细胞培养；
S4.反复贴壁富集永生化成肌细胞
S41.步骤S3所得细胞进行细胞消化，并用培养基重悬，把细胞全部种到培养容器中，静置培养；
S42.将上清移至新的培养容器中，静置培养；
S43.重复步骤S42至少4次，取得最后一次静置培养获得的贴壁细胞，即得到富集后的永生化成肌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中培养至贴壁细胞数为500～8571个细胞/cm2，cm2是指是指细胞培养容器的培养面积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中培养至贴壁细胞数为850～4285个细胞/cm2，cm2是指是指细胞培养容器的培养面积。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述离心条件为800～1500g离心20～60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述离心条件为1100g离心30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S22中依次重复S21一至四次；优选地，步骤S22中依次重复S21两次，进行二轮感染和三轮感染。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S21中培养时间为8～24小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S43中重复步骤S42操作3-8次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中静置培养时间为0.25-1.2小时；优选地，步骤S4中静置培养时间为1小时。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述病毒为基因工程化的病毒载体，其中包装有用于永生化成肌细胞的基因和用于抗性筛选的基因。
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