[发明专利]一种成肌细胞永生化的方法

说明书

本发明公开了一种永生化成肌细胞的方法。该方法采用低密度培养，结合离心条件下逆转录病毒感染，并结合反复贴壁富集永生化成肌细胞的改进，以及操作条件的优化控制，极大提高逆转录病毒感染细胞效率，大幅提高永生化成肌细胞的得率。本方法对于起始样本量非常少，尤其是起始样本中成肌细胞比例非常低、低于10％甚至只有1％的样本，仍然可以成功永生化成肌细胞，且大部分样本可保证最终得到纯度在70％以上永生化的成肌细胞，本发明方案可以使得所有肌营养不良症患者受益，具有很好的应用价值和前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种永生化成肌细胞的方法，所得永生化成肌细胞可用于肌营养不良的病理生理学和治疗靶点的研究及相关药物的开发研究。

背景技术

肌营养不良症是指一组以进行性加重的肌无力和支配运动的肌肉变性为特征的遗传性疾病群。肌营养不良症包括先天性肌营养不良症、Becker型肌营养不良等多种类型。部分肌营养不良症会导致运动受损甚至瘫痪。临床上主要表现为不同程度和分布的进行性加重的骨骼肌萎缩和无力，也可累及心肌。肌营养不良的病理生理学和治疗靶点的研究一直受到人类成肌细胞有限增殖能力的限制。从病人的肌肉活检样本中分离制备出可靠和稳定的永生化成肌细胞系是研究病理机制，包括与肌肉老化有关的病理机制的有力工具，也是开发基于基因、细胞或药物生物疗法的创新工具。2011年Mamchaoui K等发表的文章《Immortalized pathological human myoblasts:towards a universal tool for thestudy of neuromuscular disorders》公开了成肌细胞永生化技术对肌营养不良疾病的意义。

正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下可生长和分裂,但经过有限次的细胞传代后,会停止增殖,发生衰老和死亡。这就限制了细胞培养技术的进一步应用.细胞永生化(cell immortalization)指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离,从而具有无限增殖能力的过程。自发永生化的几率非常小,啮齿类动物为10^-5～10^-6,而人类细胞则更为罕见，小于10^-12。因此,研究人员通过基因转染等技术将外源性永生化基因,如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等,导入目的细胞内,以增加永生化的发生率,进而建立永生化细胞株(immortalized cell strains),以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异的目的。将原代细胞转染端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase,hTERT)，可以激活端粒酶活性，维持端粒长度，阻止染色体端粒降解，诱导细胞永生化。细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin-dependentkinase4；CDK4)参与细胞增殖和分化的调控。通过特定的逆转录病毒感染成肌细胞，表达hTERT和CDK4，可介导成肌细胞永生化。2007年Chun-Hong Zhu等发表的文章《Cellularsenescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reversetranscriptase and cyclin-dependent kinase 4:consequences in aging muscle andtherapeutic strategies for muscular dystrophies.》是“通过表达hTERT和CDK4，介导成肌细胞永生化”技术原理起源文章，通过逆转录病毒感染，表达hTERT和CDK4，并且培养基中含有地塞米松和肝细胞生长因子(HGF)的组合，使得细胞增值潜力得到提高。但是，在逆转录病毒介导的永生化肌源性细胞系的研究中，研究者发现携带蛋白依赖性激酶4(Cyclin-dependent kinase4；CDK4)和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase；hTERT)的逆转录病毒感染细胞效率低，导致难以获得永生化的细胞，原因是CDK4、hTERT基因较大，且加入了后期用于筛选永生化细胞的抗性基因，逆转录携带的目的基因较大。