[发明专利]一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法

权利要求书

1.一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因连接到载体质粒上，得到重组质粒；所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶来源于Gluconobacter frateurii NBRC 3264；所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到重组菌株；

（3）将重组菌株接种到含有氨苄青霉素的培养基中培养后，在诱导剂的作用下，于低温诱导培养；培养结束后离心收集菌体，菌体经缓冲液重复洗涤后，使用阿洛醇溶液重悬菌体，重悬的菌体再经摇床培养后离心取上清液，上清液煮沸后经超高速离心或超滤，所得的清液中即含有D-阿洛酮糖。

2.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化条件为：将重组质粒以1：10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴后热击，再立即冰浴，而后加入LB液体培养基中复苏，再将菌液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，静置培养过夜；再挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加氨苄青霉素，37℃摇床培养后得到重组菌株。

3.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的诱导培养的条件为：将重组菌株以1%的接种量接种到含有氨苄青霉素的LBG培养基中，37 ℃培养，然后加入诱导剂IPTG，并降低温度至20 ℃，继续摇床诱导培养。

4.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，其浓度为20 mM，pH为10.0。

5.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中阿洛醇溶液浓度为100 g/L，是由pH为10.0、浓度为20 mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制得到的。

6.根据权利要求5所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中摇床培养的条件为：重悬的菌体用阿洛醇溶液重悬至细胞用量OD₆₀₀为40-80，置于45-50 ℃的摇床中反应10-12 h，得到反应液。

7.根据权利要求6所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中超高速离心或超滤的条件为：将反应液14000rpm离心取上清液，上清液煮沸后再离心，或经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，得到的清液中即含有D-阿洛酮糖。

8.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述清液中D-阿洛酮糖的浓度高于50 g/L。