[发明专利]一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法

说明书

本发明公开了一种利用含有NAD(P)‑依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D‑阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：对NAD(P)‑依赖型醇脱氢酶基因adh进行优化合成，构建重组质粒pETDuet_‑1‑MCSⅡadh、构建重组菌株、利用重组菌株作为生物催化剂催化阿洛醇生产D‑阿洛酮糖。本发明方法简单、条件温和、转化效率高，且是首次证实含有NAD(P)‑依赖型醇脱氢酶的菌株能够用于催化阿洛醇生产D‑阿洛酮糖，因此本发明方法不仅有效的拓展了D‑阿洛酮糖的生产方法，还可用于D‑阿洛酮糖的大规模生产。

技术领域

本发明属于稀有糖生物转化技术领域，具体涉及一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

随着经济的蓬勃发展，人民的生活水平得到极大地改善，但是与此同时亚健康人员增多，高血压、糖尿病、肥胖人群与日俱增，具有低热量、低吸收等特点的稀有糖引起人们的广泛关注。稀有糖被国际稀有糖协会（International Society of Rare Sugars，ISRS）定义为自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。

D-阿洛酮糖是一种超低热量稀有糖，虽具有糖的甜味，但甜度是蔗糖的70%，不会被人体代谢利用，是蔗糖和高果糖浆的理想替代品。D-阿洛酮糖可以改善食品质地，减少食品加工过程中的氧化，增加食品保水能力，从而提供食品愉悦口感。另外，D-阿洛酮糖还是一种有效的抗肥胖和抗糖尿病的甜味剂，它能抑制血糖升高，提高胰岛素敏感性，降低餐后血糖反应，抑制肝脏脂肪生成酶活性，减少腹部脂肪堆积，清除活性氧等。D-阿洛酮糖被美国食品和药物管理局(FDA)批准为“一般认为是安全的”(GRAS，GRN No. 400)，并被允许用作食品和膳食补充剂的成分。

自然界的D-阿洛酮糖主要存在于甘蔗、小麦和鼠刺等植物中，含量微少，不利于大量生产D-阿洛酮糖。虽然利用化学合成法可以实现D-阿洛酮糖的生产，但是该方法操作复杂，副产物多，不利于后期D-阿洛酮糖的分离纯化，且对环境不友好。

目前，D-阿洛酮糖主要通过差向异构酶（如D-阿洛酮糖 3-差向异构酶或D-塔格糖3-差向异构酶）催化D-果糖的方式得到，但反应平衡点不利于D-阿洛酮糖的生成，转化率较低，仅在30%左右，因此造成分离纯化困难，不利于高效率、低成本地大规模工业化生产D-阿洛酮糖。

另外，根据稀有糖生物转化策略（Izumoring策略），D-阿洛酮糖也可以通过生物氧化反应，由阿洛醇生物转化得到。菌株Bacillus pallidus Y25和Enterobacter aerogenesIK7的静息细胞反应可以实现由阿洛醇直接生产D-阿洛酮糖，该微生物转化法制备D-阿洛酮糖，虽不涉及热力学平衡问题，且工艺步骤简单，但微生物的存在底物浓度低、催化时间长、生产周期长、反应条件各异，产物提取工艺复杂等问题，也会导致总成本偏高，不适合工业化生产。因此，探索一种操作简单，成本低，可以实现D-阿洛酮糖的规模化生产的方法就显得非常重要。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，该方法首次通过含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株实现了由阿洛醇生产D-阿洛酮糖，且方法简单、转化率高。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明提供了一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：