[发明专利]一种用于Hi-C的动物组织提取方法

权利要求书

1.一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)样本处理，取离体新鲜组织进行剔除处理，处理后使用清洗剂清洗，然后将所述组织切成长宽高小于0.5cm的组织样本；

2)组织交联，将步骤1)中的组织样本转移至含有组织交联液的玻璃研磨棒中，进行组织破碎后转移至离心管，室温摇匀，离心，弃上清液，再加入解交联液重悬组织，室温摇匀，离心，弃上清液，进行2～3次预处理，得到沉淀组织；

3)组织裂解及其酶切，沉淀组织转移到1.5ml EP管中，往里加入NEB Buffer2、ddH2O以及1％SDS，轻柔吸打混匀，65℃孵育10min，立即放置于冰上冷却，然后加入10％Triton X-100,轻柔吸打混匀，加入BSA与HindIII，轻柔吸打混匀，37℃孵育过夜；

4)生物素标记以及连接，取步骤3)的样品进行生物素标记以及连接；

5)核酸提取，取步骤4)中生物标记后的样品进行核酸提取；

6)片段化以及生物素富集，将步骤5)提取的DNA溶液进行片段化以及生物素富集处理。

2.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于：所述组织包括肝脏组织或肌肉组织其中的一种。

3.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于：剔除处理包括剔除结缔组织、脂肪组织、毛发与非研究所需的组织类型。

4.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于：所述清洗剂包括预冷PBS或生理盐水其中的一种。

5.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于：所述组织切成长宽高均为1mm的组织样本。

6.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于：所述步骤2)中所述组织交联液为0.01M PBS、2％甲醛溶液与10mM EDTA的混合溶液，所述交联液为0.01MPBS与2.5M甘氨酸的混合溶液；所述预处理为加入预冷的Buffer-A轻柔重悬，离心，弃上清液。

7.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于，所述步骤4)中步骤3)的样品进行生物素标记及其连接步骤如下：

(1)每100ul体积的样品加入0.3ul 10mM ATP、0.3ul 10mM TTP、0.3ul 10mM GTP、5ul0.4mM biotin-dCTP；

(2)加入2ul 5U/ul Klenow，37℃孵育1h；

(3)加入120ul 1％SDS，65℃孵育30min，立即放置于冰上；

(4)加入100ul 10％Triton X-100，涡旋混匀；

(5)加入70ul 10x T4 DNA ligase buffer、180ul ddH2O、4ul 0.1mg/ml BSA、30ul100mM DTT；

(6)加入10ul T4 DNA ligase，16℃孵育过夜。

8.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于，步骤4)中生物标记后的样品进行核酸提取步骤如下：

(1)加入10ul 20mg/ml蛋白酶K，65℃过夜孵育；

(2)加入等体积饱和苯酚，涡旋混匀，12000rpm离心5min，吸取上清液；

(3)加入等体积氯仿，涡旋混匀，12000rpm离心5min，吸取上清液；

(4)重复上一步骤，一次；

(5)加入二倍体积无水乙醇、2ul糖原以及1/10体积3M乙酸钠，涡旋混匀；

(6)-20℃静置30min，12000rpm离心10min，弃上清液；

(7)加入80％乙醇，进行漂洗一次，控干，加入52ulRSB进行溶解，吸取1ul进行定量。

9.如权利要求1所述的一种用于Hi-C的动物组织提取方法，其特征在于，步骤5)提取的DNA溶液进行片段化及其生物素富集处理如下步骤：

(1)吸取50ulDNA溶液至打断管中；

(2)放置于超声打断仪器中，选择程序中“400bp-50ul-90s”设定，进行打断；

(3)补水至体积为75ul，加入20ul T4 DNA聚合酶buffer以及5ul T4 DNA聚合酶，上PCR仪，37℃反应1h；

(4)加入1X磁珠进行纯化，加入101u lRSB进行回溶，吸取1ul进行DNA定量；

(5)吸取40ul生物素磁珠至PCR单管，上磁力架，吸弃上清；

(6)加入200ul 2xBWB，轻柔重悬，上磁力架，弃上清，该步骤重复2次；

(7)加入100ul 2xBWB，轻柔重悬，转移磁珠至步骤(4)中，吸打混匀；

(8)室温摇晃混匀45min；

(9)上磁力架，弃上清，加入1xBWB，轻柔重悬，上磁力架，弃上清液，该步骤重复2次；

(10)加入25ul纯水，重悬磁珠，将PCR单管放置于PCR仪中，98℃孵育3min；

(11)立即上磁力架，吸取上清液至新的PCR单管；

(12)再次加入25ul纯水，重悬磁珠，放置于PCR仪中，98℃孵育3min；

(13)立即上磁力架，吸取上清液至步骤(5)中的PCR单管中。