[发明专利]寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用

说明书

本发明公开了寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用。本发明方法通过在重组蛋白表达载体的构建过程中，将表达天冬酰胺‑赖氨酸‑精氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑丝氨酸(NKRRGS)的基因序列插入到表达亲合标签的基因序列和表达目标蛋白的基因序列之间，构建得到重组蛋白表达载体；然后将表达载体转入到宿主细胞中进行重组蛋白表达，纯化重组蛋白，然后加入寨卡病毒丝氨酸蛋白酶并混合，进行酶切反应，纯化后得到去除了亲和标签的目标蛋白。寨卡病毒丝氨酸蛋白酶可以广泛应用于可溶性蛋白和膜蛋白的制备、分离纯化过程中，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用。

背景技术

蛋白质纯化是一种将目标蛋白与其它蛋白分离开的技术，在生物学研究中起到重要作用。所要纯化的目标蛋白可以从生物体中直接分离出来，但是这样的操作效率极低。基因工程技术的发展促进了多种蛋白表达系统的发展。通过将目标蛋白的基因克隆出来，再构建到表达载体中，从而目标蛋白可在一些宿主细胞中进行高效表达。重组蛋白被广泛应用于科学研究以及工业生产过程中，大部分不同来源的目标蛋白都可以采取重组蛋白的方法进行分离纯化。但是，仍然有一些目标蛋白很难通过此种方法分离纯化，这主要是由于其表达水平较低、较低溶解度和对宿主细胞有毒性所致。因此，采用亲和标签的方法可以有效的提高此类目标蛋白的产量。许多亲合标签如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和多聚组氨酸标签等被广泛应用于重组蛋白的纯化中，这类亲合标签的加入，极大地增加了蛋白纯化的效率，可以提高目标蛋白的产量和纯度。由于所加入的亲合标签不属于目标蛋白，这类标签可能会影响蛋白的功能，因此，在重组蛋白的构建过程中，将人为引入蛋白酶酶切位点，再通过蛋白酶酶切的方法去除重组蛋白中的亲合标签，以达到纯化目标蛋白的目的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用。

目前有不同来源的多种蛋白酶用于重组蛋白与亲合标签的分离。但来源于寨卡病毒的蛋白酶所能够识别的酶切位点是由含正电荷的氨基酸如赖氨酸和精氨酸组成，因此，寨卡病毒的蛋白酶特别适用于切割蛋白序列中不含有其酶切位点的目标蛋白。而且，寨卡病毒的蛋白酶位于细胞膜表面，膜系统对其酶活性的影响不大，因此，此类蛋白酶适合切除目标膜蛋白两端的亲合标签。通过在目标蛋白和亲合标签之间加入天冬酰胺-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸(NKRRGS)序列，使得寨卡病毒丝氨酸蛋白酶可用于去除此种重组蛋白中的亲合标签。

本发明的第一目的是提供寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用，所述的寨卡病毒丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其酶切位点为氨基酸序列NKRRGS，所述的重组蛋白的目标蛋白中不含有氨基酸序列NKRRGS。

本发明的第二目的是提供一种亲合标签的去除方法，包括以下步骤：

在重组蛋白表达载体的构建过程中，将表达天冬酰胺-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸(NKRRGS)的基因序列插入到表达亲合标签的基因序列和表达目标蛋白的基因序列之间，构建得到重组蛋白表达载体；然后将表达载体转入到宿主细胞中进行重组蛋白表达，纯化重组蛋白，然后加入寨卡病毒丝氨酸蛋白酶并混合，进行酶切反应，纯化后得到去除了亲和标签的目标蛋白；

所述的寨卡病毒丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的目标蛋白中不含有氨基酸序列NKRRGS。

优选，所述的表达载体为pET29b载体、pET载体或pGEX载体。

优选，所述的亲合标签为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签或多聚组氨酸标签。

根据所选择的表达宿主，选择相应的表达载体。常用的表达宿主为大肠杆菌(BL21DE3)。

优选，所述的纯化重组蛋白利用亲合层析法进行，所述的酶切反应后的纯化是经分子筛层析柱纯化得到目标蛋白。