[发明专利]一种粉葛愈伤组织的诱导方法

说明书

本发明公开了一种粉葛愈伤组织的诱导方法，涉及药用植物生物技术领域，包括粉葛外植体的取材与筛选，外植体的消毒灭菌，愈伤的诱导，愈伤的增殖，获得愈伤组织，其中诱导培养基中含有浓度为0.7mg/L的6‑BA以及浓度为0.2mg/L的NAA，其中增殖培养基中含有浓度为0.1‑0.9mg/L的6‑BA，浓度为0‑1mg/L的2,4‑D以及浓度为0.2‑0.8mg/L的IBA。本发明优化调整粉葛增殖培养基的浓度配比，提高粉葛愈伤的诱导率及增殖率，该方法具有培养简单，增殖量多，周期短等优点，通过该方法可成功诱导粉葛愈伤组织，为获得其次生代谢产物提供方法基础。

技术领域

本发明属于药用植物生物技术领域，具体涉及到的方法是：筛选一种特定培养基及培养条件提高粉葛愈伤诱导率的方法。

背景技术

葛根为豆科(Leguminosae)植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi或甘葛藤Pueraria thom-sonii Benth.的干燥块根，后者习称“粉葛”，主产广西、广东、四川、云南等地，贵州亦多有分布。葛根为常用中药，性辛凉、味甘，归脾、胃经，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的功效，多用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、麻疹、热痢、头晕等症。粉葛含有丰富的淀粉、膳食纤维、氨基酸、微量元素等对人体有益的成分，是国家卫生部首批批准的药食同源两用植物。葛根是我国传统中药材，始载于《神农本草经》，现代药理学研究表明，其有效成分在维持心血管系统稳定性、保护脑神经、抗氧化、抗肿瘤、保护神经组织、防止肝肾损伤、改善代谢与免疫功能等方面均有一定的作用。

愈伤组织是组织培养最常见的一种培养形式，愈伤组织是原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。愈伤组织培养具有多种用途，一方面可研究植物生长发育及分化的机制进行基因遗传转化，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良、种质保存和有用化合物生产的理想途径。

粉葛的愈伤组织是大规模生产次生代谢物质的重要前提，较高的愈伤组织诱导率对于后期愈伤组织的分化奠定良好的基础，如何获得较高的愈伤组织诱导率与培养基类型、激素的种类和浓度以及培养条件有密切的关系。以往关于粉葛组织培养的研究中，多集中在粉葛诱导丛生芽，诱导生根等方面的较系统全面，但粉葛愈伤诱导还未见文献报道过系统全面的研究。

本发明通过对外植体的筛选、不同激素配比、培养条件、继代周期、继代次数等进行探索，结合粉葛愈伤生长的特点，提出了一种可以让粉葛愈伤诱导率较高的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的技术中愈伤诱导率低的问题，以粉葛健壮的幼嫩茎段为外植体，可在短时间内获得大量的愈伤组织，为粉葛悬浮培养体系的建立及次生代谢产物的生产的前期工作打下基础。

本发明的技术方案：

一种诱导粉葛愈伤组织的方法，包括外植体的获取与筛选、外植体的消毒灭菌、愈伤诱导条件的筛选、愈伤组织增殖条件、继代周期、继代次数的探索，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体的获取与筛选：选取长势较好的粉葛植株，取粉葛幼嫩健壮的茎段，幼嫩无病虫害的叶片，及健壮的根，剪下作为外植体，经消毒灭菌后接种于诱导培养基上，分别在第10天、20天、30天统计其诱导率；

(2)外植体的消毒灭菌：将健壮的茎段、幼嫩无病虫害的叶片、健壮的根，放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻刷洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其分类为根、茎、叶分别装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s,然后用无菌水清洗2-3次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8-10min，最后用无菌水冲洗5-7次，然后取茎段接种于诱导培养基中；