[发明专利]一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建及应用

权利要求书

1.一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建方法及应用，其特征在于：构建的转基因小鼠全身性的表达stop-EGFP-Cas9-tracrRNA元件，经过改造的供体细胞来源的外泌体包含crRNA或sgRNA，由于stop元件的存在，EGFP的基因阅读框发生移码突变，构建的转基因小鼠开始并不表达绿色荧光，当把携带crRNA或sgRNA的外泌体通过尾静脉注射的方式注射进小鼠时，Cas9/tracrRNA/crRNA三者或Cas9/sgRNA二者在细胞内形成一个核糖核蛋白复合体(RNP)，对stop序列两端进行剪切，细胞内部发生非同源末端修复(NHEJ)，修正EGFP基因阅读框，EGFP蛋白正常表达，可以通过绿色荧光蛋白直观地观察外泌体在体内的分布。具体操作包括以下步骤

构建表达stop-EGFP-Cas9-tracrRNA元件的质粒

构建表达crRNA或sgRNA元件的质粒

供体细胞的构建及外泌体的验证

转基因小鼠的构建，繁育和鉴定

示踪外泌体转基因小鼠模型验证。

2.按照权利要求1所述，其特征在于表达stop-EGFP-Cas9-tracrRNA元件的质粒中，stop-EGFP的序列，该组合表达序列由下列核苷酸构成：

3.按照权利要求1所述，其特征在于表达stop-EGFP-Cas9-tracrRNA元件的质粒中，tracrRNA的序列，该序列由下列核苷酸组成：

tracrRNA：5’-AGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT-3’。

4.按照权利要求1所述，其特征在于表达crRNA或sgRNA元件的质粒中，crRNA/sgRNA的序列，该序列由下列核苷酸组成

crRNA-1：5’-ACAGCAGAATATCACACAGCGTTTTAGAGCTATGCT-3’

crRNA-2：5’-AATCCATGCAAAACTGACTGGTTTTAGAGCTATGCT-3’

sgRNA-1：5’-ACAGCAGAATATCACACAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’

sgRNA-2：5’-AATCCATGCAAAACTGACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’。

5.按照权利要求1所述，其特征在于供体来源的外泌体包含靶向stop序列两端的crRNA/sgRNA序列。

6.按照权利要求1所述，其特征在于用于提供外泌体的供体细胞可以为免疫系统的细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞等，或间充质干细胞、内皮细胞和上皮细胞或HEK-293细胞，A549细胞等各种癌细胞。

7.按照权利要求1所述，其特征在于用于全身性表达stop-EGFP-Cas9-tracrRNA元件的受体包括小鼠，大鼠，裸鼠，斑马鱼等动物。

8.按照权利要求1所述，其特征在于供体来源的外泌体除了包含crRNA或sgRNA之外，还包含蛋白质、核酸、脂类等。

9.编码权利要求2-4所述序列的载体，所述载体包括质粒载体和病毒载体；其中，病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒载体中的至少一种。