[发明专利]一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建及应用

说明书

本发明公开了一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建方法及应用，具体实施过程主要包括：构建表达stop‑EGFP‑tracrRNA和表达crRNA或sgRNA的质粒；供体细胞的构建和外泌体的验证；转基因小鼠的构建，繁育和鉴定；示踪外泌体转基因小鼠模型验证五个部分，最终成功获得用于外泌体示踪的转基因小鼠模型；该模型的成功构建，为外泌体作为一种基因药物载体的研究奠定了基础，科学家们更容易和明确的观察到病理或者生理情况下外泌体在体内的分布。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，某些细菌或古细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称为CRISPR的存储空间；当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效；CRISPR-Cas9的机制就是驱动免疫作用，他的作用机理可以分为三个阶段来理解1.获得：通过摄取外源DNA序列，并将其整合为新的CRISPR间隔区而产生免疫；2.表达：CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA(crRNA的前体)，和与pre-crRNA序列互补的tracrRNA(反式激活crRNA)；pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体；3.干扰：crRNA-Cas核糖核蛋白复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列；这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域， DNA双链将被解开，形成R-Loop；crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态；随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物；Cas9 蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链；最终在Cas9的作用下DNA双链断裂(DSB)。

在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式(NHEJ)对断裂的DNA进行修复；但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，(移码突变：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码子改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列；)使靶标基因失去功能，从而实现源DNA的表达被沉默。

目前CRISPR/Cas9系统以应用面广，操作简单，效率高等优势广泛应用于动物，植物，微生物以及人类细胞中；利用基因编辑技术在构建基因敲除小鼠、遗传性疾病研究、抗病毒研究、癌症研究、功能基因筛选、转录调控研究、单分子标记研究和基因治疗研究等领域中有着广泛应用。

外泌体是一种起源于胞内多囊体、由细胞主动分泌大小为30～150nm的脂质双分子层小囊泡；外泌体表面携带来源细胞膜上的相应抗原，内部包含来源母细胞胞内的多种小分子，包括蛋白质、DNA及RNA等；外泌体广泛的存在包括尿液、唾液、血液和积液，乳汁，羊水，腹水等多种体液中；在细胞之间进行信息交流并发挥调控功能

随着细胞生物学和医学的不断发展，外泌体的研究越加深入，已有不少文献报道了外泌体作为一种天然内源性药物载体的重要应用；和传统的病毒载体及非病毒载体相比，外泌体作为传递信号分子的载体具有免疫原性低，运载药物的效率高，渗透滞留效应(EPR)强，具有一定的靶向性，可以更好的渗入到肿瘤或炎症部位，以及外表面有着区别于普通合成的脂质体的复杂而特殊的蛋白及磷脂双分子层结构，有利于保护所负载的药物避免被网状内皮系统捕获，获得更长的体内循环时间，实现被动靶向等优点；但是，在利用外泌体作为基因药物的载体前，我们必须对于外泌体药物在体内的分布和降解过程进行研究，所以迫切需要一种动物模型用于外泌体的体内示踪。

发明内容