[发明专利]一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选

说明书

本发明公开了一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选。本发明所要针对目标抗原为膜蛋白，将目标抗原表达在细胞膜上，并将该目标抗原与细胞膜内侧的效应蛋白结构域偶联。同时将针对目标抗原的特异性抗体文库通过跨膜肽表达在细胞膜表面，并且通过跨膜肽与胞内效应蛋白结构域偶联。如果细胞表面抗体和抗原双方能够发生作用，与双方所融合表达的效应蛋白结构域会重新组装成为有功能的效应蛋白，通过转录报告基因报告所述抗体与抗原的成功结合。采用本发明的技术方案可以快速有效的筛选出针对目标抗原的特异性抗体。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选。

背景技术

多次跨膜蛋白(multi-pass membrane proteins,MMPs)是一类重要的膜蛋白质受体，主要包括了G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors，GPCRs)和离子通道蛋白(Ion channel proteins)，前者为7次跨膜蛋白，介导胞外信号向胞内转导；后者为跨膜次数不确定的筒状膜蛋白，介导细胞内外离子交换。MMPs在生命活动中起到重要的作用，所以成为一类重要的药物靶点。早期通过小分子药物对MMPs功能进行干预，但是由于许多MMPs，尤其是GPCR家族蛋白具有极高的序列同源性和结构的保守性，因此大部分小分子药物对MMPs选择性不强，会出现许多不确定的交叉反应，导致副作用明显。

单克隆抗体因为良好的靶点特异性和长效性成为一种优秀的靶向药物。随着生物技术的发展，有目的单克隆抗体药物开发成为了可能，很快成为药物开发的热点。但针对MMPs的单克隆抗体药物开发仍然困难重重。根据2019年上市抗体药物统计，仅有2种GPCR的靶向抗体药物上市，其余抗体药物的靶点均为单跨膜蛋白或粘附分子，这说明MMPs单抗的开发难度很大。

目前，MMPs单抗药物开发的最大的困难是如何取得天然结构的抗原。目前最常用的抗体筛选技术为杂交瘤技术和噬菌体展示技术，两者都需要纯化的、具有天然构象的目标蛋白作为基础，或作为免疫原用于免疫动物(杂交瘤技术)，或作为抗原对文库进行淘洗(噬菌体展示技术)。而MMPs恰恰是一种极难纯化的蛋白质，因为MMPs依赖细胞质膜维持天然结构，现有的纯化技术难以在不将MMPs从磷脂双分子层上剥离(去垢剂法)的情况下对其进行纯化，而一旦MMPs从脂双分子层上剥离，就会导致构象严重改变。

一些方法使用人工磷脂分子恢复MMPs的天然结构，但是收效甚微。另一些方法通过单独表达MMPs的胞外结构作为抗原，但仍然无法保证抗原的结构。还有方法绕过蛋白纯化步骤，直接将表达有MMPs的载体细胞用于免疫动物，避免了对MMPs天然构象的破坏。但是这种方法常常无法成功，可能因为免疫失败的原因包括靶蛋白丰度低、无免疫佐剂、种属间序列同源导致免疫耐受等问题。也有文献报，通过将靶基因直接转染到动物体内表达，产生免疫应答，制备杂交瘤。这些方法虽然克服了抗原构象问题，但是这些载体中表达的膜蛋白不能引起充分的免疫反应，在实际应用中鲜有成功的报道。同理，没有天然构象的MMPs分子作为抗原，各种抗体展示技术(包括噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、昆虫病毒展示等)均无法对文库进行淘洗，也就无法进行有效筛选。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选，用于筛选针对膜蛋白的抗体，例如单克隆抗体。

本发明所要针对的目标抗原为膜蛋白，可将目标抗原表达在细胞膜上，将该目标抗原与细胞内侧的效应蛋白结构域偶联。同时将抗体文库(如单链抗体文库或Fab文库)通过跨膜肽表达在细胞膜表面，并且通过跨膜肽与胞内效应蛋白结构域偶联。如果细胞表面抗体和抗原双方能够发生作用，与双方所融合表达的效应蛋白结构域会重新组装成为有功能的效应蛋白，通过转录报告基因报告所述抗体与抗原的成功结合。采用本发明的技术方案可以快速有效的筛选出针对目标抗原的特异性抗体。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种针对膜抗原的抗体文库筛选方法，所述方法包括以下步骤：