[发明专利]一种当归早期抽薹种子的鉴定方法

权利要求书

1.一种当归早期抽薹种子的鉴定方法，其步骤是：

a．种子取样准备

①种子取样：在市售种子中随机抽样，剔除杂质和病虫种子；

②种子贮藏：将a.①种子样品装入纸袋，外套自封袋，内加吸水纸，置4 ℃冰箱备用；

b．培养基制备

①营养培养基配置：准确称取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g和琼脂15g，用蒸馏水定容至体积1000 ml；

②培养皿准备；选择规格一致的培养皿，洗净烘干备用；

③培养基分装与灭菌；将b.①制备好的培养基分装入②培养皿，每皿装入30 ml培养基，高压灭菌后备用；

c．当归种子内生菌的提取和分离培养

①种子表面灭菌：首先将a.②当归种子去除果皮和果柄，用流水冲洗干净，无菌条件下干燥后称取当归种子1 g，用流水冲洗10 min，置超净工作台用无菌水冲洗3～4次，再用75%的乙醇表面灭菌1 min，再用无菌水冲洗3～4次，最后用2.5%的NaClO充分震摇处理10min，随后无菌水再次冲洗3～4次，以确保当归种子表面不带菌，最后冲洗的无菌水收集于无菌培养皿中，备用于检测带菌情况；

②当归种子内生菌提取：在无菌条件下，将c.①无菌当归种子置于无菌研钵中，先加入9.9 mL无菌水，再加入2 g无菌石英砂研磨10 min；研磨后的原液密度分数为1×10-1，再分级稀释至1×10-2 和1×10-3；贮藏4 ℃冰箱备用于微生物分离培养；

③当归种子内生菌分离培养：培养地点应选择无菌环境，用涂布法接种，以接种培养基作为对照，涂布好的培养基置28℃培养箱中培养；

d．当归种子内生菌菌落鉴定

①确定菌落鉴定时期：培养7 d 后开始统计菌落数,计数时逐皿计数，乘以其稀释倍数；

②菌落鉴定：按照菌落形态、色泽、大小和结构归类菌落种类，计算丰富度指数（richness），以揭示生物群落中菌落种类丰富程度，丰富度指数（richness index，R）＝(S－1)/lnN，式中，S为某种菌落数，N为菌落总数；

③综合评判：早期抽薹种子可培养内生细菌菌落数量多，排列密集，平均菌落数大于50.0×105 CFU g-1，同种菌落形态多样，铜绿色菌落优势度突出，但菌落种类单一，平板可见10～15种菌落，而正常成熟当归种子可培养内生细菌菌落数量少，排列分散，金黄色菌落清晰可见，平均细菌菌落总数为小于1.0×105 CFU g-1，同种菌落形态单一，特异性强，但菌落种类多，平板可见20～30种菌落。