[发明专利]基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

a、将预先制备的卵巢或阴道脱细胞基质粉末加入到胃蛋白酶溶液中进行消化，得到质量分数为3.0~3.5%的脱细胞基质溶液；其中，所述胃蛋白酶溶液的浓度为18~22 mg/mL；

b、在所得的脱细胞基质溶液中滴加碱液，使pH为7.0-7.3，从而得到流动态的脱细胞基质溶液；

c、制备明胶和海藻酸钠的混合胶溶液，其中，明胶的质量分数为13~17%，海藻酸钠的质量分数为2~4%；

d、将步骤c所得的明胶和海藻酸钠混合胶溶液加入到经步骤b处理的脱细胞基质溶液中，混合均匀后即得到所述复合生物墨水，其中，混合胶溶液与脱细胞基质溶液的体积比为1~3∶3。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤a中，所述卵巢脱细胞基质粉末通过以下方法制备：

（1）机械处理：取新鲜的猪/牛/人卵巢组织，去除卵巢周围组织，并将卵巢组织剪成组织块，用冷生理盐水冲洗；

（2）低渗溶液处理：将卵巢组织置于3~5℃含苯甲基磺酰氟的去离子水中，震荡处理36~60h，且每12 h换液一次；

（3）离子型洗涤剂处理：将经步骤（2）处理的卵巢组织置于pH为 7.8~8.2、温度为3~5℃的含苯甲基磺酰氟和十二烷基硫酸钠的Tris-HCl 溶液中，震荡处理10~14h，然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（4）非离子型洗涤剂处理：将经步骤（3）处理的卵巢组织置于pH为 7.8~8.2、温度为3~5℃的含苯甲基磺酰氟和Triton X-100的Tris-HCl 溶液中，震荡处理6~8d，并每12h换液一次；然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（5）酶处理：将经步骤（4）处理的卵巢组织置于pH为 7.3~7.6、温度为35~38℃的含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl 溶液中，震荡处理12~13h，然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（6）打孔：将经步骤（5）处理后的卵巢组织置于温度为3~5℃、质量分数为4~6%的过氧乙酸溶液中，震荡处理1.5~2.5h，然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（7）将经步骤（6）处理后的卵巢组织消毒后冻干，冻干块经研磨即得卵巢脱细胞基质粉末。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤a中，所述胃蛋白酶溶液用0.01mol/L的盐酸溶液配制而成，消化处理为：在37℃下震荡处理24~26h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤b中，所述碱液为0.1mM NaOH溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤c中，混合胶溶液的配制过程为：将称取的明胶和海藻酸钠置于无菌去离子水溶液中，并于50~55℃融溶混合20~40min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤d中，明胶和海藻酸钠混合胶溶液与脱细胞基质溶液的体积比为2∶3。

7.一种权利要求1~6制备的任一复合生物墨水在3D生物打印人造卵巢或人造阴道中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，将复合生物墨水经巴氏消毒后包裹种子细胞，然后置于无菌打印料筒中，3~5℃控温10~20min，之后装入3D打印喷头内，设置喷头温度18~22℃，平台3~5℃控温5-20min，模型导入，并进行参数设置，开始进行3D打印，打印完成后，用5%CaCl₂交联5~10min，使打印物成型稳定。