[发明专利]基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用。制备方法包括以下步骤：a、将预先制备的卵巢或阴道脱细胞基质粉末加入到胃蛋白酶溶液中进行消化；b、在所得的脱细胞基质溶液中滴加碱液，使其pH为7.0‑7.3；c、制备明胶和海藻酸钠的混合胶溶液；d、将步骤c所得的混合胶溶液加入到经步骤b处理的脱细胞基质溶液中，混合均匀后即得到所述复合生物墨水。本发明将脱细胞基质溶液与混合胶溶液经特定比例混合后得到出丝顺畅稳定、打印物成型稳定，且有较好的生物相容性的复合生物墨水。通过实验证明，本发明的复合生物墨水打印的组织材料与天然组织基质更接近，更有利于细胞生长和组织修复。

技术领域

本发明涉及生物墨水技术领域，具体地说是涉及一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用。

背景技术

卵巢癌、卵巢早衰、多囊卵巢综合征均可造成女性卵子发生发育和排卵障碍致不孕不育，严重影响女性的生殖健康。人工卵巢是未来有希望的生育力保护技术之一。人工卵巢旨在模拟卵巢的两个代表性功能：产生卵子和释放类固醇激素。从解剖学上或理想状态，人工卵巢应该包含从冷冻保存的卵巢组织或其他卵巢组织中分离出来的卵泡，同时还需要一个合适的输送支架，该支架具有生物相容性、最小的炎症反应、生成新生血管且植入后可降解等特性，从而不会干扰卵泡的生长和迁移。按照支架材料的来源，组织工程支架材料主要有天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料是指以由重复单元连接成的线型长链为基本结构的高分子量化合物，是存在于动物、植物及生物体内的高分子物质。该材料来源广泛，价格较低，具有良好的生物相容性、生物降解性和亲水性，而且无毒无害。但是有些材料的机械强度和加工性能较差，难以加工成支架且存在降解速度过快的问题。目前，使用较多的天然高分子材料包括胶原、胶原蛋白、海藻酸盐、明胶、琼脂糖、壳聚糖、甲壳素、纤维素、透明质酸等。合成高分子材料如聚乳酸、聚乙烯醇、聚丁酸等，是指用结构和相对分子质量已知的单体为原料，经过一定的聚合反应得到的聚合物。该材料最大优点之一是可以根据临床应用的具体要求定制力学性能，还可以大批量且均匀地制造，并且具有较长的保质期。但是其降解产物可能引起一些免疫排斥反应，对生物体产生不利影响，且不包含细胞粘附所必需的分子，需要加入生物活性因子来刺激这一功能。选择哪种基质用于离体卵泡和细胞的移植是生物工程人造卵巢开发中最具挑战性和最关键的因素之一。

目前，无论是天然高分子材料和合成高分子材料，均已被用于创建人造卵巢原型。但研究表明，天然高分子材料是构成人造卵巢的首选基质。脱细胞的细胞外基质，由于其保留了天然细胞外基质的生理成分、低免疫原性等许多优点，已经被初步用于构建人造卵巢的研究。2015年，Laronda等人首次成功地从脱细胞的牛和人卵巢组织中构建了支架，其支持去卵巢小鼠的卵泡生长和卵巢功能的恢复。2017年，另一项研究将巴马小型猪的卵巢去细胞，然后结合体外和体内研究评估脱细胞卵巢细胞外基质的超微结构和生物相容性。2019年，Pors等人优化了人类卵巢组织的脱细胞方案，并通过将小鼠和人窦前卵泡和其他卵巢细胞重新接种，在体外和体内测试脱细胞支架的生物功能，研究表明脱细胞人卵巢组织能支持人卵泡存活和小鼠卵泡生长。尽管去细胞卵巢组织基质取得了这些有希望的结果，但要在基质的天然孔隙中找到适合不同大小卵泡的精确匹配是非常有挑战性的，严重影响卵泡的种植数量和成活率。一种替代方案是将该基质转化为温敏性水凝胶。这种方法可以完美地包裹分离的卵泡和其他卵巢细胞，同时保留脱细胞的卵巢组织成分。Chiti等人将牛脱细胞卵巢细胞外基质转化为水凝胶并对其进行了表征，证明分离的小鼠窦前卵泡可以成功地在这种基质中存活。