[发明专利]一种连续发酵驯化丝状真菌的方法

说明书

本发明涉及一种连续发酵驯化丝状真菌的方法。本发明在接近于中试发酵的反应器中，当发酵液菌浓度稳定时，排出发酵液，同时添加碳源、氮源、维生素、无机盐，逐渐将发酵液配制为筛选发酵体系；维持碳源在5‑20g/L，氮源浓度(总氮量计)为0.1‑1g/L，pH为5.5‑8.5，发酵液体积不变，获取可利用特定原料的丝状真菌。本发明有利于简化丝状真菌驯化工艺，由于直接采用中试规模进行驯化，所得到的丝状真菌菌种适用性强，更易于工业化规模生产。

技术领域

本发明涉及一种通过连续发酵驯化丝状真菌的方法，具体涉及驯化可利用特定氮源的高山被孢霉的方法。

背景技术

菌株有其自己的特性，在发酵工程中需要通过长时间的尝试来找到菌株的最适发酵条件。随着工艺和需求的发展和成本的控制，需要对已有的发酵条件进行改变，例如改变碳源、氮源的添加量及碳氮比，改变无机盐的添加量等等。

氮源对微生物生长及产物合成来说非常重要，氮源的改变很有可能使得微生物的生长代谢发生障碍，从而导致微生物生长缓慢或者产物产率偏低，所以就需要根据特有的条件对菌株进行特定氮源的驯化。生物合成过程中，培养基中氮的形式，对微生物的生长及代谢产物的大量合成有很大的影响。

高山被孢霉是一株具有较强脂质合成能力的产油微生物，其脂质积累受培养基中碳、氮源调控，目前的工艺在生产ARA时，多采用天然氮源，能够达到较好的发酵效果。但是天然氮源由于来源、加工方法不同，其质量不稳定，且微生物对有机氮源中的氨基酸的利用有选择性，常引起发酵波动。而采用无机或有机氮源的组合具有成本更低、工艺稳定性高等优势，是目前发酵行业研究的热点之一。

目前驯化菌株采用的是从低程度的培养变化量开始，在平板行进行单独的初筛和精筛，再进行摇瓶选育。会花费大量的人力和时间进行驯化传代、验证的工作，而且即使在摇瓶中指标良好，放大以后又会出现不尽如人意的状况。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效驯化菌株利用特定原料发酵产生代谢产物的方法，能够减少传代繁琐的操作以及较长的驯化周期。

为实现上述目的，本发明第一方面提供一种连续发酵驯化菌株的方法，包括以下步骤：

(1)发酵至菌浓度稳定时，排出发酵液，同时补充碳源、氮源、维生素、无机盐，逐渐形成筛选发酵体系；

(2)驯化过程中碳源(以葡萄糖计)维持在5-20g/L、氮源浓度(按总氮浓度计)为0.1-1g/L，pH为5.5-8.5，发酵液体积维持不变。

其中所述补充的氮源包括磷酸氢二铵、氨水、硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、组氨酸中的一种或多种；所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B5、生物素、胆碱、肌醇、烟酸中的一种或多种；所述无机盐包括氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钠中的一种或多种。值得注意的是，出于成本及原料获得考虑，所述谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、组氨酸包括其相对应的盐，例如所添加的可以是谷氨酸也可以是谷氨酸钠，或其混合物。

上述方法可以用于丝状真菌的菌株驯化，如高山被孢霉菌株驯化。

本发明第二方面提供一种驯化高山被孢霉的方法包括以下步骤：

(1)发酵至菌浓度稳定在40-60％时，排出发酵液，补料添加碳源、无机氮源、氨基酸、维生素、无机盐，逐渐形成筛选发酵体系；

(2)驯化过程中以葡萄糖计，碳源维持在5-20g/L、以总氮量计，氮源浓度为0.1-1g/L，pH为5.5-8.5、且维持发酵液体积不变；

(3)当发酵罐中发酵液菌浓度重新稳定在40-60％时，得到利用特定氮源的高山被孢霉菌株。