[发明专利]用一代测序评估样本DNA中碱基损伤、错配和变异的方法

说明书

本发明涉及一种用一代测序评估样本DNA中碱基损伤、错配和变异的方法，本发明在PCR扩增过程中一方面采用分子标签来标记带有损伤或者错配的DNA原始分子，另一方面对抽样区域进行富集放大扩增，将0.1％左右的损伤或者错配信息放大到10～99％，然后采用基于富集放大作用的评估方法和基于分子标签种类数量的评估方法分别评估样本DNA中碱基损伤、错配和变异的比例值，根据两种方法的可信结果，判断样本DNA中碱基损伤、错配和变异的比例值。本发明的方法能够采用经济快速的sanger测序方法准确的确认损伤或者错配真实存在，能够有利于优化样本DNA提取技术和保存方法，帮助评估样本DNA的质量。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用一代测序评估样本DNA中碱基损伤、错配和变异的方法。

背景技术

随着技术的发展，在DNA检测领域，特别是癌症检测领域，人们越来越关注低比例的突变信息，比如0.1％的体突变信息是当前液体活检领域重点关注的指标之一，逐渐地，人们也会不再满足于0.1％这个指标，而要求更进一步，如果到了0.01％这个层面，就会面临如何区分突变与错配和碱基损伤的问题。

首先明确一下突变和错配这两个概念的含义。单拷贝细胞层面上，比如单个精子和卵子，它们是单倍体，突变这个概念在单倍体细胞比较难以适用，常规的突变更多是一种群体或者集体意义上的概念，比如人基因组hg19，Chr1:2,000这个位置的碱基是C，那么如果1000个精子细胞中有1个精子细胞出现了CT的突变，其他细胞保持野生型的C，那么我们说这个位置上出现了0.1％的CT突变，而对于这个含有T的精子细胞中，Chr1:2,000这个位置是正常T:A配对，并没有出现突变，而本专利所述的错配，是指在单个精子细胞中Chr1:2,000并不是正常的C:G配对，而是T:G配对这种不符合碱基配对原则的情况，这种在双链中出现碱基配对错误，称之为碱基错配，这种碱基错配如果没有被修复系统修复，在某种情况下，被DNA聚合酶复制过一次后，就变成了正常配对的T:A和C:G，并传给了子代，那么就形成了突变，因此突变在概念上，是有一个群体的语境的。

碱基损伤和碱基错配可以是先天形成的，也可以是后天形成的；先天形成的碱基错配是指，在生物体的细胞中，细胞在进行分裂增殖的过程中，由于体内DNA复制体系的错误，为G错误的匹配上了非C的碱基，而这种错误并没有得到体内修复系统的修复，进而保留了下来；后天形成的碱基损伤是指，在我们提取DNA的过程当中，由于技术、方法和条件的不恰当或局限而发生的损伤，比如胞嘧啶C在氧化条件下，发生氧化损伤，发生了脱氨反应，变成了脱氨基的胞嘧啶，然后在复制过程中，脱氨基的胞嘧啶被认为是尿嘧啶，进而与A发生匹配；又比如G在氧化条件下，容易形成8-oxoG，然后在复制过程中，也容易oxo-G:A匹配；总体来说，一旦这些损伤的碱基和错配在生物体内稳定遗产下来，就会形成突变，在关键基因的关键位置发生的突变，并累积到一定程度，就有可能成为严重疾病的病因，比如癌症，也有可能成为耐药的原因。很明显能看出，如果是后天造成的碱基损伤，很容易给万分之一或者千分之一这个指标造成困扰，因此，评估样本中脱氧核糖核苷酸的损伤和错配是非常重要的，特别是对一些关键突变热点尤其显得重要，这些位置上碱基损伤导致的CT、GA会造成假阳性干扰。

由于这种损伤和错配发生的概率和比例是很低的，目前已知在万分之几左右，低于常规技术平台的灵敏度，比如二代测序平台的错误率在千分之几左右，因此，二代测序平台的检测灵敏度在1％左右；qPCR平台的某些技术最好的检测灵敏度在0.2％。因此在技术方面，如果要检测低比例的变异信息，是一定离不开分子标签标记技术的，但是分子标签技术严重依赖于高深度测序，而且时间周期长，不利于检测项目的推广。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开一种评估DNA样本中低比例碱基损伤或者碱基错配的方法，同时也可以评估生物体内天然存在的低比例碱基错配和碱基变化的比例，能够有利于优化样本DNA提取技术和保存方法，帮助评估样本DNA的质量。

本发明的第一个目的是提供一种用一代测序评估样本DNA中碱基损伤、错配和变异的方法，包括如下步骤：