[发明专利]一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用

说明书

本发明涉及一种信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用。本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法的检测的方法，包括下述步骤：(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；(2)加入待检测细胞和细胞刺激物或者直接加入已经和刺激物作用过的待检测细胞；(3)加入抗体‑DNA/RNA连接链或者加入抗原‑DNA/RNA连接链，作用一定时间；(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；(5)加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；(6)进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的待检测信号强度；(7)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。本发明检测方法具有信号多重放大、检测限低、灵敏度更高、可同时检测多种目标物、可多轮检测、操作简便等优点。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种基于DNA/RNA互补配对的多重信号放大系统及其用于免疫斑点法的检测。

背景技术

免疫斑点法是指将抗体结合到PVDF、醛基化多孔板等固相载体上，然后利用抗原抗体特异性结合检测细胞所分泌的细胞因子等物质的免疫学检测方法。酶联免疫斑点法(ELISPOT)是最常用的免疫斑点法，通过显色反应，在待检测细胞分泌可溶性蛋白等物质的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在仪器下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌特定物质的细胞的数量。传统的ELISPOT检测方法受限于酶和底物显色的种类，一次实验只能检测一种抗原。荧光免疫斑点法(FluoroSpot)虽然可以一次检测两种抗原，但是只能进行一轮检测且因为缺乏放大系统而导致灵敏度低。为了实现同时检测多种抗原或抗体信号并实现多轮检测，本发明采用DNA互补配对技术制备了一种检测灵敏度高的多级多重信号放大系统，并将其应用于免疫斑点法的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法的检测的方法，包括下述步骤：

(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；

(2)加入待检测细胞和细胞刺激物或者直接加入已经和刺激物作用过的待检测细胞或者直接加入未经刺激物刺激的待检测细胞后作用一段时间；

(3)去除细胞和/或细胞刺激物并洗涤；加入抗体-DNA/RNA连接链或者加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；

(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；

(5)加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；

(6)进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的待检测信号强度；

(7)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。

本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，在固相基质上包被抗体或抗原后，加入封闭液进行封闭。

本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测细胞包括但不限于人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒、其他任何来源的任一种或多种。

本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述细胞刺激物可为任何与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。

本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗体/抗原分子连接一个或多个连接中间体。

本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。