[发明专利]一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法

说明书

本发明公开了一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其包括，获取孕鼠大脑皮质和海马组织；用DMEM/F12基础培养液制备所述海马组织的单细胞悬液；用神经干细胞培养液重悬，接种、培养形成细胞球；消化所述细胞球，终止后过滤得单细胞悬液，接种后传代培养，收集细胞球；消化收集到的所述细胞球，终止后用神经干细胞培养液重悬，接种，让悬浮的单细胞贴壁，继续用神经干细胞培养液培养；所述神经干细胞培养液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF组成。本方法可明显提高体外培养的大鼠海马RGCs的纯度，可达97％左右。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法

背景技术

目前已证实，放射状胶质细胞(Radial glia cells,RGCs)是一类形态、生物学特性和功能上独特的细胞，为神经胶质细胞的一种，具有典型的细而长的突起，为双极性形态。在胚胎时期是一类干细胞，其放射状的突起可以担当新生未成熟神经元的“脚手架(scaffolding)”,引导神经元长距离迁移，到达某些特定区域并分化为成熟神经细胞,与局部区域建立突触联接；还具有NSCs功能，作为神经前体细胞，通过不对称分裂与对称分裂产生神经元或神经胶质细胞。RGCs呈现出神经上皮细胞和胶质细胞的特征，能表达干/祖细胞的标记物，比如Nestin、Sox2，同时也能表达一些星形胶质细胞标记物，如脑脂结合蛋白(brain lip id bindingprotein,BLBP)、Vimentin、RC1、RC2、C腱糖蛋白(tenascin-C,TN-C)、谷氨酸盐转运蛋白(glutamate transporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)、S100等。目前关于RGCs的分离培养，有学者应用具有2μm槽的聚甲基丙烯酸甲酯(ln2 PMMA)支架，模拟胚胎神经干细胞池的生物微环境，体外诱导RGCs培养，然而获得的RGCs仅达到80％。用此纯度不高的细胞作为研究对象，对后续的实验研究带来诸多干扰因素，导致实验结果不稳定。因此如何提高体外培养的大鼠海马胚胎RGCs的纯度成为关键问题。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。本发明的主要目的在于提供一种体外纯化培养大鼠海马RGCs的方法。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其包括，获取孕鼠大脑皮质和海马组织；用DMEM/F12基础培养液制备所述海马组织的单细胞悬液；用神经干细胞培养液重悬，接种、培养形成细胞球；消化所述细胞球，终止后过滤得单细胞悬液，接种后传代培养，收集细胞球；消化收集到的所述细胞球，终止后用神经干细胞培养液重悬，接种，让悬浮的单细胞贴壁，继续用神经干细胞培养液培养。

作为本发明所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述神经干细胞培养液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF组成。

作为本发明所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述接种，其接种的细胞密度为1×10⁴个/ml～1×10⁵个/ml。

作为本发明所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述接种、培养形成细胞球，其接种的细胞密度为1×10⁵个/ml；所述接种后传代培养，其其接种的细胞密度为1×10⁴个/ml。