[发明专利]一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种动物单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将目的组织用预冷的5mL、1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm³的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；

S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20～50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块，停止解离，制得解离细胞液；

S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL预冷的1×PBS缓冲液，并用细胞筛过滤1～2次，然后离心，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL预冷的1×PBS缓冲液，用移液枪吹打混匀，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1～5min，制得细胞裂解物；

S5、将步骤S4制得的细胞裂解物重悬、离心处理，重复2次，去除上清液，用细胞筛过滤1～2次，用3mL预冷的1×PBS缓冲液冲洗一次，离心去除上清液，制得细胞沉淀；

S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2～3次，然后离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，筛选浓度在800-1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1、S3～S6中所述的预冷的1×PBS缓冲液为4℃预冷、含质量百分数为0.04％的BSA的缓冲液。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1×HBSS缓冲液，质量百分数为10％的胶原蛋白酶，质量百分数为5％中性蛋白酶，2U/mL的DNA酶I，质量百分数为10％的透明质酸酶。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的细胞筛孔径为70μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述的红细胞裂解液的制备过程为将8.29g NH₄Cl，1g KHCO₃，37.2mg EDTA-2Na混合，加蒸馏水定容至1000ml，调节PH至7.4。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述的重悬、离心处理，重复2次的具体操作为：将细胞裂解物置于5mL、1×PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1×PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min，去掉上清液。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述的细胞筛孔径为40μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比7～10：1～4组成；所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

9.一种利用权利要求1所述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将制备的细胞悬液置于冰上，于30min内建库。