[发明专利]一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。本发明提供的制备方法，主要包括取样、酶解、重悬洗涤、活性计数等过程，采用本发明所述的制备方法可以制备出活性高达95％的单细胞悬液，且能够应用在多个物种不同组织单细胞悬液制备，可满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，具有很高的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。

背景技术

目前新一代高通量单细胞测序平台(例如，以10×genomics平台为代表)以高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性，能从不同大分子层面来研究单个细胞，成为单细胞研究的重要技术研究方式，可广泛应用于肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等重要领域。由于高通量单细胞测序仪器一般要求细胞在液相中实现流动分选，所以要求投入的样本必须为细胞悬液。然而在实际研究过程中，往往因细胞悬液的细胞总量不够、细胞活性不高、细胞成团、细胞碎片等问题达不到上机建库要求，很多研究项目因悬液质量问题而被迫取消，因此，亟待开发一套成熟的方法用于制备合格的单细胞动物悬液。

目前酶消化法是制备实体组织单细胞悬液最常用的方法，首先需要破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，其次破坏组织细胞的紧密连接结构的蛋白，再清除组织粘多糖物质。中国发明专利CN111621466A公开了一种肺动脉组织单细胞悬液的制备方法，中国专利CN110951683A和CN110747164A均公开了一种牙髓干细胞的制备方法，中国专利CN104357395A公开了从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法，中国专利CN107748130A公开了一种动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法，但这些方法都只针对某一类组织，应用场景有限。中国发明专利CN111647549A公开了一种动植物中单细胞的分离方法，该方法中使用的硝酸镧含有金属离子镧，会抑制反转录酶的活性，影响后续单细胞转录组测序文库构建的数据质量，而且，硝酸镧属于化学危险品，对人体有害且具有助燃性。

基于上述缺陷，中国发明专利CN111088222A公开了一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，该方法虽然具有步骤简单，获得的细胞数量多，制得的单细胞悬液可用于10×Genomics等高通量单细胞测序平台等优点，但是采用该方法制得的细胞活性仍然在90％以下，且该方法涉及到的酶较多，在制备过程中，细胞容易被杂菌污染。

综上可知，开发一种高通量单细胞测序平台通用的，易于操作的动物单细胞悬液制备方法迫在眉睫。

发明内容

基于现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。采用本发明所述的制备方法可以制备出活性高达95％的单细胞悬液，且能够应用在多个物种不同组织单细胞悬液制备，具有很高的应用价值。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种动物单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

S1、将目的组织用预冷的5mL、1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm³的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；

S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20～50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块，停止解离，制得解离细胞液；

S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL预冷的1×PBS缓冲液，并用细胞筛过滤1～2次，然后离心，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL预冷的1×PBS缓冲液，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1～5min，制得细胞裂解物；