[发明专利]一种基于宏基因组学的呼吸道咽拭子样本的建库方法和病原检测方法

说明书

本发明提供了一种基于宏基因组学的呼吸道咽拭子样本的建库方法和病原检测方法，涉及微生物检测技术领域。所述建库方法包括(a)待测样本溶液预处理：加入溶菌酶进行消化；(b)样本总核酸的提取，在提取的过程中不添加carrier RNA；(c)cDNA合成：采用随机引物进行反转录；(d)使用磁珠对步骤(c)合成的产物进行纯化；(e)样本DNA文库的构建。本发明基于DNA‑RNA共测序原理，提供了一种基于宏基因组学的适合于咽拭子样本建库与检测的方法，通过单次反应就能实现咽拭子样本宏基因组的病原检测。

技术领域

本发明涉及技术领域，尤其是涉及一种基于宏基因组学的呼吸道咽拭子样本的建库方法和病原检测方法。

背景技术

引起呼吸道感染的病原种类多样，包括病毒、细菌、真菌等，其中大部分病原以DNA为遗传信息的载体，但是也有一部分病毒(如流感病毒、冠状病毒等)以RNA为遗传信息的载体。呼吸道临床样本的宏基因组测序目前已成为一种呼吸道感染病原检测的重要方法，它通过直接对样本中所有微生物核酸进行检测，不仅可以同时检测样本中存在的多种病原，也可发现一些常规方法难以识别的新发或罕见病原。由于针对DNA或RNA的测序方法上存在一些差异，目前常规的宏基因组病原检测的测序建库方法，会根据临床医生对感染病原的经验判断，选择主要针对细菌检测的DNA建库、主要针对病毒检测的RNA建库，或者同时做DNA和RNA两次建库。然而实际工作中很多病例可能无法根据经验判断引起感染的病原是细菌、病毒或其他种类病原，而且一旦选择了错误的建库方法可能导致病原的漏检。另一方面，咽拭子是一种常规的无创的呼吸道样本，常用于呼吸道病原检测，但是样本中的核酸含量一般较少，如果选择同时进行DNA与RNA进行2次建库，不仅增加了检测时间与成本，而且核酸含量一般也难以满足2次建库。因此，开发一种单次反应就能实现咽拭子样本宏基因组病原检测的方法就十分有必要。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于宏基因组学的呼吸道咽拭子样本病原检测方法。本发明基于DNA-RNA共测序原理，提供了一种基于宏基因组学的适合于咽拭子样本建库与检测的方法，通过单次反应就能实现咽拭子样本宏基因组的病原检测。

本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种基于宏基因组学的呼吸道咽拭子样本的建库方法，所述方法包括：

(a)待测样本溶液预处理：加入溶菌酶进行消化；

(b)样本总核酸的提取，在提取的过程中不添加carrier RNA；

(c)cDNA合成：采用随机引物进行反转录；

(d)使用磁珠对步骤(c)合成的产物进行纯化；

(e)样本DNA文库的构建。

本发明考虑到在咽拭子样本溶液的处理中，需要兼顾咽拭子样本中可能存在的革兰氏阳性菌等难以裂解的病原，因此在核酸提取前加入溶菌酶消化的步骤，可以提高核酸提取效率。

采集咽拭子样本，并制备待测样本溶液(咽拭子样本液化)；在待测样本溶液中加入溶菌酶进行消化。

在一个实施方案中，所述方法在步骤(a)中，所述溶菌酶的加入量为所述待测样本溶液体积的1/50，所述溶菌酶的浓度为50mg/mL。

在一个实施方案中，所述方法在步骤(a)中，加入溶菌酶后，充分混匀，于37℃孵育15min。