[发明专利]一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及临床检验领域，特别涉及一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。本发明中稀释缓冲液添加苯扎溴铵，能改变血浆中纤维蛋白原的结构或状态，避免纤维蛋白原干扰凝血酶裂解底物的反应速率，提高检测抗凝血酶III活性的准确性。

技术领域

本发明涉及临床检验领域，特别涉及一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及 其制备方法。

背景技术

正常人体内血液凝固过程的促进与抑制，二者处于动态平衡状态。作为 人体内最重要的抗凝物质，抗凝血酶Ⅲ(以下简称AT-III)控制着血液凝固 和纤维蛋白溶解的过程，从而维持机体的凝血平衡，因此AT-III活性的变化 是诊断弥漫性血管内凝血(DIC)、肝硬化、败血症、血栓形成性疾病(心肌 梗塞，静脉血栓形成等)、先天性AT-Ⅲ缺陷、血友病、再生障碍性贫血的 重要指标。

AT-III是一种球蛋白，在肝内合成。研究表明抗凝血酶Ⅲ的含量或者活 性低既有遗传性的也有获得性的。先天性遗传引起的血液中抗凝血酶Ⅲ缺乏 又分为I型和II型，I型抗凝血酶Ⅲ缺乏的特征是抗凝血酶Ⅲ合成的降低，血 液中抗凝血酶Ⅲ含量和活性均降低。II型抗凝血酶Ⅲ缺乏的特征是抗凝血酶 Ⅲ合成正常，血液中抗凝血酶Ⅲ含量正常，但由于部分抗凝血酶Ⅲ功能丧失， 表现出抗凝血酶Ⅲ活性降低。获得性的抗凝血酶Ⅲ含量或者活性低的原因有 多种，例如肝病引起的抗凝血酶Ⅲ合成减少；肾病引起的抗凝血酶Ⅲ流失；肝素等药物引起的抗凝血酶Ⅲ损失，以及弥散性血管内凝血引起的抗凝血酶 Ⅲ消耗。无论是遗传性的还是获得性的抗凝血酶Ⅲ缺失症都给患者带来血栓 的风险，给他们的健康和生命带来难以预测的威胁。抗凝血酶Ⅲ活性的检测 在先天性抗凝血酶Ⅲ缺陷或异常的临床诊断具有非常重要的意义。

目前检测抗凝血酶Ⅲ的方法有两种，一种为检测抗凝血酶Ⅲ抗原的含量， 如免疫分析法，此法方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时，而且无法 测定II型抗凝血酶Ⅲ缺乏；另一种为检测抗凝血酶Ⅲ的活性，如凝固法和发 色底物法，凝固法是通过血浆凝固时间来测定样本中AT-Ⅲ活性，由于受影 响的因素较多，因此特异性，准确度较差，而且操作繁琐。目前，在市场销 售的试剂盒中，底物发色法是测定血浆中抗凝血酶Ⅲ活性的通用方法，此法 具有灵敏度高、准确性好、检测时间短等特点，且能够适用于多种自动化分 析仪器，临床上已被广泛应用。

底物发色法的原理：抗凝血酶Ⅲ(AT-III)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶 抑制物，是凝血酶(FⅡa)与活化的凝血因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅹ等蛋白酶的抑制剂。 在过量的丝氨酸蛋白酶存在下，血浆中的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶形成1： 1的复合物从而抑制此蛋白酶的活性，剩余的没有和抗凝血酶Ⅲ形成复合物的 蛋白酶作用于特异的发色底物，将底物裂解产生4-硝基苯胺(4-nitroaniline， pNA)显色基团，4-硝基苯胺的浓度和其在405nm处的吸光度的变化呈正相关， 而产生的4-硝基苯胺的量与抗凝血酶Ⅲ的活性成反比。因此，通过检测405nm 处吸光度的变化，可计算出血浆中抗凝血酶Ⅲ的活性水平。

美国专利US5546007和中国专利CN102690862A公开了一种以凝血酶为 基础的发色底物法检测抗凝血酶Ⅲ活性的试剂盒，两者分别对离子浓度的优 化和肝素衍生物的筛选，达到降低肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)干扰抗凝血酶Ⅲ活 性测定的影响，但是凝血酶与发色底物在水溶液下不稳定，不宜久存。此外， 中国专利CN106153612A发表了一种以活化因子X(FXa)为基础的发色底物 法测定抗凝血酶Ⅲ活性的试剂盒，此法避免了样本中肝素辅因子以及药物水 蛭素、阿加曲班、达比加群等抗凝血因素的干扰。然而活化因子X(FXa)极 易失活，价格昂贵，增加试剂盒制作成本。

无论是以凝血酶为基础的，还是以活化因子X(FXa)为基础的底物发色 法，都要求过量的凝血酶或FXa存在，根据凝血瀑布学说，血浆中其他凝血 因子或多或少均能消耗或灭活凝血酶和活化因子X的活性，从而干扰抗凝血 酶Ⅲ活性的检测。