[发明专利]一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条

权利要求书

1.一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板(1)，在所述底板(1)上自左至右依次分布有样品垫(2)、金标垫(3)、层析垫(4)和吸收垫(5)；其特征在于，所述层析垫(4)内含有FAM单抗，所述层析垫(4)包括粘贴在所述底板(1)的硝酸纤维素膜(6)、检测线(7)与质控线(8)，所述质控线(8)平行排布于检测线(7)的左侧，所述质控线(8)内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线(7)内抗体为羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述底板(1)的材料为PVC或PS；所述样品垫(2)的材料为玻璃纤维素膜，其长度为15～20mm；所述金标垫(3)的材料为聚酯纤维素膜，其长度为5～8mm；所述层析垫(4)长度为25～30mm；所述吸收垫(5)的材料为吸水纸，其长度为15～20mm。

3.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫(3)、吸收垫(5)分别与层析垫(4)两端边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫(3)、吸收垫(5)位于层析垫(4)上方；所述金标垫(3)与层析垫(4)重叠1mm-1.5mm；所述吸收垫(5)与层析垫(4)重叠2mm。

4.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫(2)与金标垫(3)边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫(3)位于样品垫(2)与底板(1)之间。

5.一种使用如权利要求1-4任一所述的胶体金试纸条进行新冠病毒检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)N和ORF基因目标片段扩增

采用人工合成的含有新冠病毒N基因和ORF基因序列的质粒，取2*P6High-fidelitypremix试剂盒，在引物带领下，使用PCR仪对测试基因N和ORF目标片段进行扩增；

2)crRNA转录模板退火

根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORF DNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列；

利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+AsCas12a的scaffold序列(TAATTTCTACTCTTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNA PAM序列后的20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R，合成靶向N基因和ORF基因的crRNA-F/R两条寡核苷酸链，退火合成双链DNA；

3)体外转录crRNA

将crRNA-F/R退火合成双链DNA，体外转录并纯化获得N-crRNA、ORF-crRNA；

4)构建新冠病毒检测体系

取体外转录并纯化的N-crRNA和ORF-crRNA，N和ORF稀释成1nM和10nM，与AsCas12a250nM、ssDNA-FQ 500nM、crRNA 500nM置于缓冲液中；

5)检测分析

对测试基因N和ORF进行检测：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，CRISPR产物用PBS或者纯水稀释到80μl，滴加到胶体金试纸条的样品垫上，等待5-10min，观察并分析检测结果。

6.根据权利要求5所述的一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤1中N和ORF基因目标片段扩增引物名称与引物序列为：

N-target-PF-2：AAGGCCAACAACAACAAGGC

N-target-PR-2：TTTAGGCTCTGTTGGTGGGA

ORF-target-PF-2：ATCCTTTGGTGGTGCATCGT

ORF-target-PR-2：TTTAGCAAAACCAGCTACT。