[发明专利]一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条

说明书

本发明公开了一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条，本申请基于Cas12a的基因编辑，Cas12a能够在引物带领下特异性地识别新冠病毒N基因和ORF基因上的结合位点，随后Cas12a被激活，可以非特异性的剪切标记有荧光基团和猝灭基团的探针序列，切断后的探针可发出荧光，可以直接用qPCR检测新冠病毒，也可以用普通PCR扩增后，采用本申请设计的胶体金试纸条检测，本申请将基因编辑以及免疫层析技术试纸条技术结合起来，可快速完成对新冠病毒核酸的特异性检测，大大提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和效率。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条。

背景技术

为了应对新型冠状病毒(COVID-19)，迅速出现了多种新冠病毒检测方法，主要分为抗体检测，抗原检测，核酸检测等，由于新冠IgM/IgG抗体出现相对滞后，不利于及时发现感染，而抗原检测的检出率偏低，不能满足临床需要，因此临床确诊主要采用核酸检测法。

目前新冠病毒核酸检测的方法主要有荧光定量PCR，可以将微量的核酸序列放大到能够被仪器检测到的水平，检测灵敏度高，能够检测处于潜伏期的病原体，该方法获批的检测试剂生产厂家很多,产能也满足实际需求，但该方法需要BSL-2级实验室、实时荧光定量PCR仪和核酸提取仪等苛刻条件和昂贵设备，且检测周期较长(3-4小时)，试剂耗材成本高。

等温扩增技术是近年来新出现的一种简易核酸扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同温度下具有活性的酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。与PCR相比，等温扩增对仪器的要求大大简化甚至不需要仪器，反应时间也大大缩短，能更好满足快速简便检测的需求，常用的等温扩增法有环介导恒温扩增法(LAMP)，重组酶介导恒温扩增法(RAA)，和重组酶聚合酶扩增法(RPA)等，在恒定温度也能高效扩增核酸，摆脱了热循环仪的限制，但是容易产生假阳性信号。

发明内容

针对上述技术背景中的问题，本发明目的是提供一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法与胶体金试纸条。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板，在所述底板上自左至右依次分布有样品垫、金标垫、层析垫和吸收垫；所述层析垫内含有 FAM单抗，所述层析垫包括粘贴在所述底板的硝酸纤维素膜、检测线与质控线，所述质控线平行排布于检测线的左侧，所述质控内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线内抗体为羊抗鼠IgG。

进一步地，所述底板的材料为PVC或PS；所述样品垫的材料为玻璃纤维素膜，其长度为15～20mm；所述金标垫的材料为聚酯纤维素膜，其长度为5～8mm；所述层析垫长度为25～30mm；所述吸收垫的材料为吸水纸，其长度为15～20mm。

进一步地，所述金标垫、吸收垫分别与层析垫两端边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫、吸收垫位于层析垫上方；所述金标垫与层析垫重叠 1mm-1.5mm；所述吸收垫与层析垫重叠2mm。

进一步地，所述样品垫与金标垫边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫位于样品垫与底板之间。

本发明的另一目的，使用上述胶体金试纸条进行新冠病毒检测的方法，包括如下步骤：

1)N和ORF基因目标片段扩增

采用人工合成的含有新冠病毒N基因和ORF基因序列的质粒，取 2*P6High-fidelitypre mix试剂盒，在引物带领下，使用PCR仪对测试基因N 和ORF目标片段进行扩增；

2)crRNA转录模板退火

根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORF DNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列；