[发明专利]一种精准调控α-葡聚糖酶解反应并定向萃取特定分子量产物的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种精准调控α‑葡聚糖酶解反应并定向萃取特定分子量产物的方法及其应用，属于生化分离技术领域。本发明利用葡聚糖既是可以组成相体的聚合物，其分子量也是影响成相条件的关键因素，通过调整其他高聚物相体组成，使酶解反应最终目标分子量落在分相点上。同时，利用α‑葡聚糖酶在部分聚合物相中的高分配系数实现将酶蛋白快速从反应相中回收，中止酶解反应，并在低分子量α‑葡聚糖分离后，通过特定的对α‑葡聚糖酶蛋白亲和的浓盐溶液对酶进行重新回收。

技术领域

本发明属于生化分离技术领域，涉及一种水相萃取技术的扩展应用，尤其涉及一种精准调控α-葡聚糖酶解反应并定向萃取特定分子量产物的方法及其应用。

背景技术

食品或者药品工业目前所需低分子量的α-葡聚糖生产流程为：发酵-乙醇沉淀-水解-分离纯化-冻干。其中水解方法主要有酶解和酸解两种，也有方法将发酵和水解工序同时进行，例如CN101205257是通过发酵得到高分子量的α-葡聚糖后酸解到目标分子量产物，再经多级膜分离、离子交换树脂脱盐和活性炭脱色等步骤获得成品。酸解对最终产物的分子量分布范围控制能力较好，但强酸会引起较多副反应，特别是产生大量单糖，可能增大下游产品色值。CN103993052是通过使用水解酶在发酵过程中直接对分子量进行控制，实现一步制备。酶解具有较高特异性，但不同来源的同工酶水解特性不一，对不同分子量的底物可能反应强度不同，也可能存在酶蛋白不易灭活，易使产物分子量分布变宽，同时酶作为蛋白质高温灭活时与还原糖发生美拉德反应，也会引起色值升高。CN105671104是将分泌水解酶的棘孢青霉菌和醋杆菌分别固定在卡拉胶基质形成微球后，方便酶与反应底物分离，达到控制酶促反应的目的。但是固定化发酵普遍存在溶质交换受阻，导致发酵效率降低，碳源和氮源利用率下降的问题。CN200810122697.4提出一种通过双水相体系回收水解木聚糖后剩余木聚糖酶的方法，专利涉及连续生产的装置设计，其中水相系统的组成并不涉及木聚糖而且仅是实现酶的重复利用。

水相萃取技术有别于传统纯化技术，反应条件温和，时间短；且所有试剂均为非挥发性的无毒药品，特别适合生物材料的纯化应用。聚合物与盐溶液分相的原理是利用阳离子与微小高密度电荷的多原子阴离子之间的相互作用被抑制，使得盐离子靠近聚合物表面区域时受到阻碍，并形成无盐且定向的水化层区域，当两者浓度达到一定值时促使发生两相分离。根据聚合物分子量、密度、界面张力和电位差等因素，蛋白质、核酸、病毒及细胞颗粒等在不同水相系统均有相应的分配行为，形成水相萃取纯化的理论基础。现有技术多将水相萃取纯化技术应用于酶工程或添加其他高聚物进行多糖纯化，尚未见有将原料直接参与到水相系统的组成中达到纯化产物目的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种精准调控α-葡聚糖酶解反应并定向萃取特定分子量产物的方法；本发明利用葡聚糖既是组成相体的聚合物，其分子量也是影响成相条件的关键因素，通过调整其他高聚物相体组成，使酶解反应最终产物的目标分子量落在分相点上。同时，利用α-葡聚糖酶在部分聚合物相中的高分配系数实现将酶蛋白快速从反应相中回收，中止酶解反应，并在低分子量α-葡聚糖分离后，通过特定的对α-葡聚糖酶蛋白亲和的浓盐溶液对酶进行回收。

本发明的另一目的在于提供上述精准调控α-葡聚糖酶解反应并定向萃取特定分子量产物的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种精准调控α-葡聚糖酶解反应并定向萃取特定分子量产物的方法，包括如下步骤：

(1)标准曲线的制备

a)分别配置质量分数为0％～25％的α-葡聚糖标准溶液和质量分数为50％～60％的聚乙二醇溶液，将上述α-葡聚糖标准溶液逐滴加入聚乙二醇溶液中至混合液出现浑浊，记录混合液中质量分数为0％～25％的α-葡聚糖溶液变浑浊时对应的聚乙二醇溶液的质量分数，以混合液中α-葡聚糖标准溶液的质量分数为横坐标，聚乙二醇溶液的质量分数为纵坐标制作α-葡聚糖-聚乙二醇标准曲线；