[发明专利]利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α‑葡聚糖的方法及其应用，属于酶促反应调控技术领域。本发明利用葡聚糖既是可以组成相体的聚合物，其分子量也是影响成相条件的关键因素，通过调整其他高聚物相体组成，使酶解反应最终目标分子量落在分相点上，达到自发中止反应的目的。同时，利用α‑葡聚糖酶在部分聚合物相中高分配系数实现将酶蛋白快速从反应相中回收，中止酶解反应，并在低分子量α‑葡聚糖分离后，通过浓盐溶液重新回收酶蛋白。

技术领域

本发明属于酶促反应调控技术领域，特别涉及利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法及其应用

背景技术

食品或者药品工业目前生产低分子量α-葡聚糖工艺由以下几个步骤组成：发酵-乙醇沉淀-水解-分离纯化-冻干。其中，水解方式一般有酸解和酶解，诸多改进方案都集中水解与其他工序的结合上，例如CN101205257是通过发酵得到高分子量的α-葡聚糖后酸解到指定分子量，在经过多级膜分离、离子交换树脂脱盐和活性炭脱色的步骤获得成品。CN103993052是通过使用水解酶在发酵过程中直接对α-葡聚糖分子量进行控制，实现一步制备。CN105671104是将分泌水解酶的棘孢青霉菌和醋杆菌分别固定在卡拉胶基质微球上，通过控制酶与反应底物的接触，达到调节酶促反应的目的。总体来说，酸解对水解产物的分子量分布范围控制能力较好，但触发的副反应较多，特别是产生大量的单糖，易增大下游产品的色值，加重下游纯化难度；酶解具有特异性，副产物较少，但同工酶之间酶学性质不一，反应进程不易控制，终产物分子量分布较宽。固定化发酵易出现菌体生长速度降低，营养物利用率下降的问题。水相萃取技术有别于传统纯化技术，具有反应条件温和，时间短，所有试剂均为非挥发性的无毒药品，特别适合生物材料的纯化工作，其原理是利用聚合物长链分子的氢键与所处环境中的水分子相互作用后形成互为几何饱和但结构显著差异的液相。根据聚合物分子量、密度、界面张力和电位差等因素，蛋白质、核酸、病毒及细胞颗粒等在不同水相系统均有相应的分配行为，这形成水相萃取纯化的理论基础。CN103571806提出通过双水相萃取右旋糖酐蔗糖酶，其中目标对象为合成酶，催化方向相反，其次需要引入外源性的α-葡聚糖，无法实现对最终α-葡聚糖分子量的控制。由于α-葡聚糖自身作为水相萃取常见的构成组分，一般不会考虑将其参与到相应α-葡聚糖酶的水相萃取和反应体系当中，目前尚未见有在水相萃取系统中水解α-葡聚糖过程快速中止反应并回收游离的α-葡聚糖酶的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法；本发明基于水相萃取原理，本发明的α-葡聚糖既是组成相体的聚合物，又是酶促反应的底物。α-葡聚糖分子量是影响成相条件的关键因素，通过调整其他高聚物相体组成，使酶解反应最终目标分子量落在分相点上。同时，利用α-葡聚糖酶在部分聚合物相中的高分配系数，实现将酶蛋白快速从反应相中回收，中止酶解反应，并在低分子量α-葡聚糖分离后，通过特定的对α-葡聚糖酶蛋白亲和的浓盐溶液重新回收。

本发明的另一目的在于提供上述利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法，包括如下步骤：

取聚丙二醇、聚乙二醇(PEG4000)和α-葡聚糖的混合液，震荡混合，静置分层，从上到下分成三层，上相为聚丙二醇相、中相为聚乙二醇相、下相为α-葡聚糖相，将α-葡聚糖酶加入到中相与下相接近两相界面处，轻微震荡后，保温，观察到中下相开始混合后，离心，此时液体分成上下两相，取下相，加入酒精，离心，取沉淀即为目标低分子量α-葡聚糖；向上述上相液体中加入硫酸镁溶液，震荡后静置分层得到两相，上相为聚丙二醇相，下相为盐溶液相，取下相，超滤脱盐浓缩后，获得α-葡聚糖酶回收液。

所述的聚丙二醇、聚乙二醇(PEG4000)和α-葡聚糖的混合液中，聚丙二醇、聚乙二醇(PEG4000)和α-葡聚糖优选按质量比6.5～9:4～8:12～17。