[发明专利]一种抗鸡新城疫转移因子的制备方法

说明书

本发明涉及一种体外制备抗鸡新城疫特异性转移因子的制备方法。本发明以鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，然后用植物血凝素和鸡新城疫诱导培养淋巴细胞，体外生产抗鸡新城疫特异性转移因子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预防和治疗鸡新城疫，同时可以提高鸡的免疫力。本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的鸡新城疫转移因子制备方法。

技术领域

本发明涉及兽药领域，更具体的说，是一种抗鸡新城疫转移因子的制备方法。

背景技术

鸡新城疫(New Castle disease)，由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟 。常呈急性败血症状 。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、黏膜和浆膜出血。死亡率高，对养鸡业危害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型(即缓发型)、中等毒力型(即中发型)、强毒力型(即速发型)3型。多数高强度毒力株常属嗜内脏型新城疫病毒。

鸡科动物都可患本病。家鸡最易感，雏鸡比成年鸡易感性更高。可达 44℃，精神萎顿，羽毛松乱，呈昏睡状。冠和肉髯暗红色或黑紫色。嗉囔内常充满液体及气体 ，呼吸困难，喉部发出咯咯声；粪便稀薄、恶臭，一般2~5天死亡。亚急性或慢性型症状与急性型相似，唯病情较轻，出现神经症状，腿、翅麻痹，运动失调，头向后仰或向一边弯曲等 ，病程可达1~2个月，多数最终死亡。 目前尚无治疗本病的的特效药，发病鸡群主要以投疫苗预防作用，但疫苗价格昂贵不易保存，容易造成免疫失败，给养殖户造成不可逆转的损失。通过药物提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防鸡新城疫的有效方法，在此过程中转移因子可起到非常重要的作用。

转移因子(Transfer factor, TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染，也可以是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用，是一种新型而又安全的免疫制剂。此外，转移因子无种属特异性，动物来源的转移因子可用于人体。

目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半透膜透析得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗鸡新城疫特异性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化生产以及大范围应用具有很好的促进作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗鸡新城疫特异性转移因子的制备方法。

本发明体外制备抗鸡新城疫特异性转移因子的制备方法，按照以下步骤进行：

（1）无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血15-20ml，加0.8%肝素溶液0.2m1抗凝，静置20-40min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS (pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度600-1000转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；

（2）对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察（1）中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；

（3）抗鸡新城疫特异性转移因子的制备。当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素（终浓度为50-100mg/L）和鸡新城疫（终浓度为1000-1500血凝单位/ml）诱导培养，离心培养2-3天后，8000转/分、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析12-24h，超滤除菌，即获得体外制备抗鸡新城疫特异性转移因子。