[发明专利]一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系及构建方法

权利要求书

1.一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系，所述食源性病原菌包括金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、福氏志贺菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、艰难梭菌，其特征在于，该PCR检测体系通过PCR引物组对食源性病原菌DNA进行PCR扩增获得检测结果；

所述PCR引物组中各引物分别以金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、福氏志贺菌的ipaH基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌的lysP基因和艰难梭菌的tpi基因为靶标进行设计与合成得到，包括10μmol/L的nuc引物、10μmol/L的hlyA引物、5μmol/L的ipaH引物、3μmol/L的lysP引物和2μmol/L的tpi引物；

反应液配制为：

所述PCR扩增的反应条件为：

2.如权利要求1所述的PCR检测体系，其特征在于，所述PCR引物组中，

所述nuc引物为：

nuc引物F：5'-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3'，

nuc引物R：5'-AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT3'；

所述hlyA引物为：

hlyA引物F：5'-CAGCATTGATTTGCCAGGAAT-3'，

hlyA引物R：5'-AATCTGGAAGGTCTTGTAGGT-3'；

ipaH引物为：

ipaH引物F：5'-TACCGTCTCTGCACGCA-3'，

ipaH引物R：5'-TCGAAAAGGCCTTCTGATGC-3'；

lysP引物为：

lysP引物F：5'-CGTCATTAGCATCTTCAGCAGTT-3'，

lysP引物R：5'-GATGATTTAGCAAAAGTAGTTGTTGCA-3'；

tpi引物为：

tpi引物F：5'-CGTCATTAGCATCTTCAGCAGTTG-3'，

tpi引物R：5'-GATGATTTAGCAAAAGTAGTTGTTGCA-3'。

3.权利要求1所述的PCR检测体系的构建方法，其特征在于，该方法以初始检测体系为基础进行以下优化过程：

(1)五种菌的单重PCR优化检测体系

以所设计与合成的引物应用到上述初始检测体系中，对应食源性病原菌中各菌分别进行PCR特异性扩增，以扩增产物条带正确且唯一为指标，选择特异性强的所述nuc引物、hlyA引物、ipaH引物、lysP引物和tpi引物，根据引物的T_m值确定优化的退火温度；

(2)三重PCR优化检测体系

在单重PCR优化检测体系的基础上，以所述食源性病原菌中的三种菌为扩增对象选择相应扩增引物，以同时能扩增出该三种菌的三条靶基因条带为指标，优化选择出最佳的退火温度；

(3)四重PCR优化检测体系

在三重PCR优化检测体系的基础上，以所述食源性病原菌中的四种菌为扩增对象选择相应扩增引物，以同时能扩增出该四种菌的四条靶基因条带为指标，进一步优化选择出最佳的退火温度；

(4)五重PCR优化检测体系

在四重PCR优化检测体系的基础上，以所述食源性病原菌中的五种菌为扩增对象选择相应扩增引物，以同时能扩增出该五种菌的五条靶基因条带为指标，进一步优化选择出最佳的退火温度，并以此优化出各菌的最佳引物浓度。