[发明专利]一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系及构建方法

说明书

本发明公开了一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系及构建方法。本发明通过五种菌的单重PCR优化初始检测体系的引物和退火温度，进一步通过三重PCR优化出退火温度为50～59.2℃，通过四重PCR优化出退火温度为58℃和53.8℃，在此范围内通过五重PCR优化出退火温度为54℃，并进一步优化出各菌所用引物的浓度值，最终得到可同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系，该检测体系可进行多种靶基因的并行检测，检测成本低，检测效率大大提高；其中，金黄色葡萄球菌检测限为228pg，单增李斯特菌检测限为365pg，福氏志贺菌检测限为1.9pg，艰难梭菌检测限为223pg，小肠结肠炎耶尔森菌检测限为37.9pg。

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，尤其涉及一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系及构建方法。

背景技术

食源性疾病严重危害公共卫生，并在许多国家和地区造成严重的经济损失，因此，建立简单，快速和灵敏的检测方法尤为重要。与食源性相关重要病原菌(如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、福氏志贺菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、艰难梭菌等)，感染率高、传播速度快。其中，志贺菌属(Shigella spp.)是人类重要的肠道传染病病原菌，并影响肠道稳态，由志贺菌感染引起的细菌性痢疾(菌痢)，全球每年发病人数达1.647亿；金黄色葡萄球菌是引起人类食物中毒重要病原体，它是自然界中广泛分布的主要医院病原体之一；近年来，耐多药金黄色葡萄球菌的临床分离率一直在上升；小肠结肠炎耶尔森氏菌可引起严重的后遗症，例如结节性红斑和反应性关节炎等，而单增李斯特菌是一种人畜共患病原体，可引起人类和动物李斯特菌病；艰难梭菌是重要的肠道病原菌，且与食源性疾病密切相关，研究表明，该菌可以从肉中分离出来，其与人类食源性疾病的关系越来越密切。

目前临床传统检测上述食源性病原菌繁琐耗时，且准确性和灵敏度仍需提高，而发掘精准有效、简便检测手段，对食源性病原菌进行快速检测和分析，对于临床诊断、食品安全以及流行病学调查中的病原体监测具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系，旨在解决现有食源性病原菌的检测方法繁琐耗时、准确性和灵敏度不高等问题；

本发明的再一目的在于提供上述PCR检测体系的构建方法。

本发明是这样实现的，一种同时检测多种食源性病原菌的PCR检测体系，所述食源性病原菌包括金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、福氏志贺菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、艰难梭菌，该PCR检测体系通过PCR引物组对食源性病原菌DNA进行PCR扩增获得检测结果；

所述PCR引物组中各引物分别以金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、福氏志贺菌的ipaH基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌的lysP基因和艰难梭菌的tpi基因为靶标进行设计与合成得到，包括10μmol/L的nuc引物、10μmol/L的hlyA引物、5μmol/L的ipaH引物、3μmol/L的lysP引物和2μmol/L的tpi引物；

反应液配制为：

所述PCR扩增的反应条件为：

预变性：94℃、5min，

变性：94℃、30s，

退火：54℃、30s，

延伸：72℃、30s，

循环数：30，

延伸：72℃、7min。

优选地，所述PCR引物组中，

所述nuc引物为：

nuc引物F：5'-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3'，