[发明专利]一种捕获单克隆抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白的亲和纯化方法

说明书

本发明公开了一种捕获抗体‑肿瘤坏死因子融合蛋白的亲和纯化方法，具体地，本发明公开了的方法包括如下步骤：(a)提供一待纯化的原料，其中所述原料含有抗体‑肿瘤坏死因子融合蛋白；(b)将所述待纯化的原料进行亲和层析，收集含有样品峰的洗脱液，所述亲和层析的填料选自下组：Mabselecct SuRe、Prism A、Mabcapture A、Amsphere A3、Eshmuno A、KancapA 3G、Unimab 50、或其组合，所述洗脱液为含有抗体‑肿瘤坏死因子融合蛋白的中间产品。用本发明方法纯化的抗体‑肿瘤坏死因子融合蛋白具有很高的纯度和收率，并且聚集体的含量极低，因此具有很高的安全性和广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化领域，具体地，涉及一种捕获单克隆抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白的亲和纯化方法。

背景技术

单克隆抗体广泛应用于肿瘤的靶向治疗，通过结合肿瘤组织细胞表面抗原分子，抑制肿瘤细胞的生长。为增强单克隆抗体的治疗效果，对单克隆抗体进行改造，如改变糖基化修饰增加ADCC功能；单克隆抗体藕连化学分子，增加杀伤效果如ADC分子；开发双特异性抗体结合不同的抗原分子，增强药物功能的协调作用；开发抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白，协调免疫细胞作用，增强抑制肿瘤细胞生长功能或杀伤。抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白由于独特的分子机制，目前发展成为肿瘤治疗分子开发的热点。抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白药物开发过程中，除关注产品的安全性和有效性外，还应重点关注分子的稳定性，特别是由于肿瘤坏死因子引起的分子聚集。

单克隆抗体制备过程中，首选Protein A层析用于单克隆抗体的捕获。Protein A层析条件采用中性pH条件结合样品，酸性pH条件下洗脱样品模式。大多数单克隆抗体采用pH3.2～3.8洗脱溶液,洗脱蛋白纯度较高且有高回收率。对于抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白，由于肿瘤坏死因子融合到单克隆抗体结构中，单克隆抗体空间结构一定程度上会发生变化，同时部分融合蛋白肿瘤坏死因子如IL-10,TNFα有趋向聚集的特性，因此，采用传统的Protein A层析条件捕获抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白存在一定的挑战。

根据单克隆抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白的特性，层析介质对单克隆抗体纯化效果有较大的影响，如采用Cytiva Capto Q，Tosoh Q-600C，以样品发生流穿的模式进行中间步骤纯化，Capto Q层析介质表现为流穿模式，而Q-600C为结合模式。亲和层析介质基质有亲水性物质如琼脂糖、纤维素，有疏水性物质如聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂等，对于疏水性基质的亲和层析介质，减少蛋白的非特异性吸附主要依赖于介质的制备工艺，改性程度、表面亲水层稳定性及均一性。蛋白分子的特性、亲和层析介质基质特性及键合Protein A的结构特性影响亲和层析蛋白纯度及收率，选择合适的亲和层析介质对抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白纯化存在一定的挑战。

Protein A层析应用于抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白的初步纯化，主要受限于层析填料的选择及层析条件，需要维持蛋白纯度和收率之间的平衡。

因此，本领域迫切需要开发一种对在不影响收率的前提下显著降低聚体含量的新方法。

发明内容

本发明的目的是一种对在不影响收率的前提下显著降低聚体含量的新方法。

在本发明第一方面，提供了一种对抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白进行纯化的方法，包括步骤：

(a)提供一待纯化的原料，其中所述原料含有抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白；

(b)将所述待纯化的原料进行亲和层析，收集含有样品峰的洗脱液，所述亲和层析的填料选自下组：Mabselecct SuRe、Prism A、Mabcapture A、Amsphere A3、Eshmuno A、KancapA 3G、Unimab 50、或其组合，所述洗脱液为含有抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白的中间产品。

在另一优选例中，所述抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白包括抗Her-2人源化单克隆抗体-肿瘤坏死因子a融合蛋白。