[发明专利]一种RNA标记物及包含该标记物的活细胞标记方法和应用

说明书

本发明涉及活细胞检测技术领域，尤其涉及一种RNA标记物及包含该标记物的活细胞标记方法和应用。所述方法包括标记待测基因，具体为使用RNA标记物一对一地标记待检测基因，所述RNA标记物包含多个茎环结构；其中，每个茎环结构独立地选自两种不同的茎环结构；任意两个不同的RNA标记物之间，所述两种不同的茎环结构中的任一种占自身茎环结构总数比例的差值为15～50％。本发明利用不同的RNA茎环结构标记基因后相对荧光强度和绝对荧光强度不同的原理实现了同时对更多种mRNA的标记和观测，拓展了可用的mRNA标记物数量，节约了所用荧光蛋白种类，对于复杂的基因网络的成像和生物学过程研究具有重要意义。

技术领域

本发明涉及活细胞检测技术领域，尤其涉及一种RNA标记物及包含该标记物的活细胞标记方法和应用。

背景技术

基于RNA茎环结构(Stem-loop)和RNA结合蛋白的成像系统是活细胞成像的常用方法。目前用于活细胞成像的RNA茎环结构种类主要有MS2，PP7，λboxB和U1A。通常而言，为了标记特定RNA，需要将多重串联的茎环结构序列插入靶基因的非翻译区，如内含子、5'UTR、3'UTR等。转录出的靶基因带有多乘RNA茎环结构，这些RNA茎环结构会招募RNA结合蛋白，RNA结合蛋白上通常会融合1-3个拷贝的荧光蛋白，从而在细胞内形成荧光点。

在诸多活细胞成像方法中，MS2系统和PP7系统目前已成为活细胞中mRNA成像的标准方法，这是由于目前现有的mRNA的功能和动力学研究确保了这两种系统的使用不会影响正常的mRNA的功能。目前利用茎环系统成像可以达到单个mRNA分子的分辨率，并可以实现对基因转录过程中从RNA产生到降解全过程的定量解析。

尽管目前活细胞成像可以达到单分子分辨率，精度也较高，但是基于茎环结构与RNA结合蛋白结合的成像方法仍有不足。其中最大的问题就是目前活细胞RNA成像的通量(可同时在一个细胞中观察的基因数)不高，很难利用活细胞RNA成像来研究基因网络层面的问题。造成这一问题的具体原因包括：(1)目前对于活细胞成像而言，在转录层面缺乏与蛋白层面一样多的可用标记物。蛋白层面利用颜色和性质(如成熟时间，降解速率)多样的荧光蛋白进行目的蛋白标记的技术目前比较成熟，可用荧光蛋白种类繁多；而对于活细胞成像而言，最广泛应用的茎环标记方法可用的茎环种类很少。(2)由于目前用于标记活细胞mRNA的RNA茎环结构主要来源于噬菌体，开发全新的RNA茎环结构相对而言耗时较长。(3)由于每种RNA茎环结构均需要一种荧光蛋白与相应的RNA结合蛋白融合以成像，部分荧光蛋白在荧光光谱上有重合，使用荧光显微镜同时观察这些荧光蛋白导致通道之间的串线，从而减少了实际可以同时观测的荧光蛋白种类。

发明内容

为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种RNA标记物及包含该标记物的活细胞标记方法和应用。本发明通过任意两种不同的RNA茎环结构对多个基因进行标记之后进行荧光检测，可以通过相对荧光强度、绝对荧光强度、及细胞定位的不同来测量出待测基因的实时表达水平等相关信息。

第一方面，本发明提供一种RNA标记物，所述RNA标记物包含24～48个茎环结构；其中，每个茎环结构独立地选自两种不同的茎环结构；每种茎环结构均至少在所述RNA标记物中存在12个。

进一步地，所述两种不同的茎环结构为两种招募不同RNA结合蛋白的茎环结构，所述两种不同的茎环结构优选为MS2、PP7、λboxB、和U1A中的任意两种；更优选为MS2和PP7。

第二方面，本发明提供一种RNA标记系统，所述RNA标记系统包括所述RNA标记物以及和所述RNA标记物中两种不同的茎环结构分别对应的RNA结合蛋白；不同的RNA结合蛋白分别连接不同类型的荧光蛋白。

进一步地，所述RNA标记物中两种不同的茎环结构分别对应的RNA结合蛋白为能够被对应的茎环结构所招募的RNA结合蛋白，例如MS2茎环结构对应MCP蛋白，PP7茎环结构对应PCP蛋白。

进一步地，所述不同类型的荧光蛋白为光谱不重叠的荧光蛋白。