[发明专利]中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法

权利要求书

1.中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、荧光定量检测目的基因的表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸提取细胞总RNA，反转录成cDNA；以β-actin作为内参基因，根据NCBI中AcerOr2序列，使用Primer Primer6.0设计引物；进行实时荧光定量PCR；

S2、Western blot检测目的基因蛋白的表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸进行裂解并提取总蛋白；用BCA法测蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳并转膜，经过封闭、一抗孵育、HRP标记的二抗孵育，于化学发光成像仪进行分析；对相关条带灰度值进行定量分析；

S3、CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标：采用计算机辅助分析仪分析W7和VUAA1对中华蜜蜂精子常规指标的影响；

S4、通过流式细胞仪检测精子DNA完整性。

2.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：步骤S1中，所述引物的序列为：

AcerOr2：

F：5′-GTGTTGTTCTGCTCCTGGCT-3′；

R：5′-GGAAGGTGGTCGTGAAGTCG-3′；

β-actin：

F：5′-GTGACGACGAAGTAGCAGC-3′

R：5′-TGACCCATACCGACCAT-3′。

3.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：步骤S1中，使用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，进行实时荧光定量PCR。

4.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：步骤S2中，使用Quantity one软件对相关条带灰度值进行定量分析，并以β-actin作为内参。

5.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：所述采用计算机辅助分析仪分析W7和VUAA1对中华蜜蜂精子常规指标的影响，具体包括：

新鲜精液经活率测定后，加入1-2倍体积稀释液，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入稀释液将精子稀释至1×10⁶个/mL；实验分三组：对照组、W7处理组和VUAA1处理组；吸取5μL稀释好的精液，滴加到20μm深的精子计数板上，在10倍物镜下调节相差光路，调准焦距，采用计算机辅助分析仪分析W7和VUAA1对中华蜜蜂精子常规指标的影响。

6.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：所述通过流式细胞仪检测精子DNA完整性，包括：

采集到的精子样本用预冷PBS(4℃)洗涤2次，加300μL 1×结合缓冲液悬浮，2000g离心10min；将结合缓冲液从细胞颗粒中去除，再悬浮于1mL1×结合缓冲液中；细胞浓度调节为1×10⁶个/mL；100μL精液悬液与5μL AnnexinV-PE溶液混合均匀，室温放置15min，加入7-AAD溶液5μL混匀，室温避光放置5-15min；采用流式细胞仪进行分析。