[发明专利]中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法

说明书

本发明适用于蜜蜂气味受体研究技术领域，提供了中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，首先通过进行荧光定量检测目的基因的表达，然后进行Western blot检测目的基因蛋白的表达，接着使用CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标，最后通过流式细胞仪检测精子DNA完整性，从而获得气味受体AcerOr2的表达和其对蜜蜂精液品质影响的相关数据，有助于探讨中华蜜蜂AcerOr2和其下游信号分子在细胞水平调节精子质量中的可能生物学作用及其对中华蜜蜂精液品质的影响，为气味受体在生殖过程中的功能研究提供理论基础。

技术领域

本发明属于蜜蜂气味受体研究技术领域，尤其涉及中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法。

背景技术

昆虫嗅觉受体(ORs)是七次跨膜离子受体。它们主要表达在嗅觉和味觉器官的神经元(ORN)的树突膜上，并参与检测挥发性气味并将这些化学信号转化为电信号。昆虫嗅觉神经元表达两类气味受体：一是传统的气味受体(ORs)，二是气味共受体(Orco)。OR/Orco复合物形成一个功能性阳离子通道，使K⁺和Ca²⁺在气味受体与气味结合后进入感觉细胞。在Orco胞内环2结构域发现了一个钙调素(CaM)保守结合区，表明CaM活性可能影响Orco的功能。在哺乳动物中，钙在调节精子功能中起着关键的作用。例如，在小鼠精子中，MOR 23调节与细胞内钙离子有关的精子运动，而抑制钙调素则降低精子活力。钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)是钙信号的一个常见下游靶蛋白，已被报道存在于哺乳动物的睾丸中。Ca²⁺/CaM/CaMKII途径影响和调节哺乳动物的精子运动。以上结果表明，Ca²⁺介导的精子活力需要钙调素(CaM)。在冈比亚按蚊、埃及伊蚊和果蝇的研究发现Orco在睾丸和精子中表达，而且精子能被Orco激动剂激活，并受到Orco拮抗剂的抑制。一个有趣的可能性是Orco介导精子对内源性信号分子的反应。

蜜蜂育种工作主要是通过选育优质高产的蜂王，而雄蜂的质量与处女王相比，具有同等重要的地位。雄蜂的优劣主要是通过其精子质量来判断。精子活率、精子密度、精子活力是衡量雄蜂精液品质的一项重要指标。雄蜂精子品质的优劣决定了蜜蜂人工受精选育的成败。到目前为止，还未见由于基因调控影响蜜蜂精液品质研究报道。

发明内容

本发明提供中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，旨在探讨中华蜜蜂AcerOr2和其下游信号分子在细胞水平调节精子质量中的可能生物学作用及其对中华蜜蜂精液品质的影响，为气味受体在生殖过程中的功能研究提供理论基础。

本发明是这样实现的，中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，包括以下步骤：

S1、荧光定量检测目的基因的表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸提取细胞总RNA，反转录成cDNA；以β-actin作为内参基因，根据NCBI中AcerOr2序列，使用PrimerPrimer6.0设计引物；进行实时荧光定量PCR；

S2、Western blot检测目的基因表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸进行裂解并提取总蛋白；用BCA法测蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳并转膜，经过封闭、一抗孵育、HRP标记的二抗孵育，于化学发光成像仪进行分析；对相关条带灰度值进行定量分析；

S3、CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标：采用计算机辅助分析仪分析W7和VUAA1对中华蜜蜂精子常规指标的影响；

S4、通过流式细胞仪检测精子DNA完整性。

2.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：步骤S1中，所述引物的序列为：

AcerOr2：

F：5′-GTGTTGTTCTGCTCCTGGCT-3′；