[发明专利]免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒

权利要求书

1.一种免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，包括如下步骤：

将石蜡切片，并放置于60℃的烘箱中烘烤1h；

将烘烤过的所述切片置于二甲苯中进行脱蜡，重复3次，每次5min；

将脱蜡完成的所述切片依次放入无水乙醇中1min、95％乙醇中30s、75％乙醇中30s，自来水中浸洗1-2min，再用PBS冲洗3次，每次3min；

将脱水后的所述切片浸于0.01M柠檬酸盐缓冲液中,微波修复5min，自然冷却至室温，再更换柠檬酸盐缓冲液，微波修复5min；

将抗原修复完成后的所述切片置于阻断剂中，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加100ul封闭液，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min，并且用免疫组化笔在所述切片上组织外3-5mm处画一个防水圈，防止液体流干；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加50-100ul一抗，于四度冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul生物素标记的二抗，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul亲和素标记的HRP，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加100ulDAB显色液，显色5-10min，期间在镜下观察，组织出现阳性即可在自来水中终止反应；

在所述切片中加入苏木素复染30s，水洗返蓝。

将返蓝完成后的所述切片依次置于75％乙醇1min、95％乙醇1min、无水乙醇1min、二甲苯2次，每次1min；

将酒精脱水后的所述切片用中性树胶封片，自然晾干。

2.根据权利要求1所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述阻断剂为0.3％过氧化氢的甲醇溶液。

3.根据权利要求1所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述一抗为CD276抗体，并且所述CD276抗体经过稀释，抗体稀释比例1:200。

4.根据权利要求1所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述生物素标记的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG。

5.根据权利要求1所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述亲和素标记的HRP为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶。

6.根据权利要求2所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述阻断剂为内源性过氧化酶阻断剂，所述内源性过氧化酶阻断剂的制备方法包括：将150μl的30％过氧化氢，缓慢加入到15ml的无水甲醇溶液中，并充分混匀。

7.根据权利要求1所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，还包括所述封闭液的制备方法，包括：将600mg的牛血清蛋白，加入到14.8ml的磷酸盐缓冲液，充分溶解后加入200μl的30％的Triton。

8.根据权利要求4所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述生物素标记的羊抗鼠IgG的制备方法包括：将150mg牛血清蛋白，加入到14.8ml的磷酸盐缓冲液中，再加入200μl的30％的Triton，以及1μl的储存液。

9.根据权利要求5所述的免疫组化的免疫酶标方法，其特征在于，所述链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶的制备方法包括：将0.2mg链霉亲和素与0.8mg辣根过氧化物酶交联，融入1ml去离子水中形成储存液；将75μl储存液加入到15ml的磷酸盐缓冲液中。

10.一种用于免疫酶标方法的试剂盒，其特征在于，包括：

内源性过氧化酶阻断剂，包括：150μl的30％过氧化氢和15ml的无水甲醇溶液；

高效封闭液，包括：600mg的牛血清蛋白、14.8ml的磷酸盐缓冲液，以及200μl的30％的Triton；

生物素标记的羊抗鼠IgG，包括：150mg牛血清蛋白、14.8ml的磷酸盐缓冲液、200μl的30％的Triton和1μl的储存液；

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，包括：75μl储存液，以及15ml的磷酸盐缓冲液，其中储存液由0.2mg链霉亲和素、0.8mg辣根过氧化物酶交联，融入1ml去离子水中形成。