[发明专利]免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒

说明书

本发明公开了一种免疫组化的免疫酶标方法，主要包括，石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、阻断、抗原修复、封闭、加入一抗、加入二抗以及加入SP、显色复染等步骤。该方法操作简易化，且通过镜检可以准确控制颜色，以免过染，确保染色效果。各个溶液的制备方法简单，且剂量适合，使用方便，避免造成浪费。还包括用于免疫酶标方法的试剂盒，包括内源性过氧化酶阻断剂、高效封闭液、生物素标记的羊抗鼠IgG和链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化酶。该试剂盒中包括上述免疫酶标方法所需的溶剂，各个溶剂采用滴瓶分瓶包装，使用方便。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒。

背景技术

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化对于肿瘤病理诊断和基础形态学研究具有重要功能意义。此种方法用于检测细胞内或细胞间正常或异常产物，进行蛋白成分定位，探讨发病机制，确定某些肿瘤组织发生及类型，筛选具有临床潜力的标志物。

免疫组化技术包括两个方面，一、识别系统，即特异性抗体识别组织或细胞中抗原；二、显示系统，即抗原抗体特异性结合通过显微镜显示出来，变为形态学上肉眼可见的反应。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。其中，免疫酶法是免疫组织化学研究中最常用的技术，基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

然而，目前的免疫组化的方法中操作复杂，染色效果极不稳定，各个染液或溶液的制备方法也极为复杂，制作成本高昂，且剂量配备不合理，在使用过程中会遇见剂量不足或过多的情况，造成使用的不方便。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种免疫组化的免疫酶标方法，包括如下步骤：

将石蜡切片，并放置于60℃的烘箱中烘烤1h；

将烘烤过的所述切片置于二甲苯中进行脱蜡，重复3次，每次5min；

将脱蜡完成的所述切片依次放入无水乙醇中1min、95％乙醇中30s、75％乙醇中30s，自来水中浸洗1-2min，再用PBS冲洗3次，每次3min；

将脱水后的所述切片浸于0.01M柠檬酸盐缓冲液中,微波修复5min，自然冷却至室温，再更换柠檬酸盐缓冲液，微波修复5min；

将抗原修复完成后的所述切片置于阻断剂中，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加100ul封闭液，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min，并且用免疫组化笔在所述切片上组织外3-5mm处画一个防水圈，防止液体流干；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加50-100ul一抗，于四度冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul生物素标记的二抗，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul亲和素标记的HRP，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加100ulDAB显色液，显色5-10min，期间在镜下观察，组织出现阳性即可在自来水中终止反应；