[发明专利]靶向SMN2启动子区MeCP2结合的关键甲基化区域的反义寡核苷酸

说明书

本发明提出靶向SMN2启动子区MeCP2结合的关键甲基化区域的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸能够结合至SMN2基因启动子区的MeCP2富集的甲基化区域来促进脊髓性肌萎缩症患者细胞中SMN2基因的整体转录水平和SMN蛋白的表达水平，可以作为SMN靶向性治疗策略中的新治疗靶点。

技术领域

本发明涉及基因治疗技术领域，特别是提供靶向SMN2启动子区MeCP2结合的关键甲基化区域的反义寡核苷酸。

背景技术

脊脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经肌肉病，由脊髓前角及延髓运动神经元变性导致，以近端肢体和躯干进行性、对称性肌无力和肌萎缩为特点，随病情进展常累及多系统。该病的发病率在存活新生儿中约为1/6000～1/10000，位居婴儿致死性遗传病的首位，其中呼吸衰竭是最常见的死亡原因。SMA的临床表现差异较大，根据患者的发病年龄和获得的最大运动功能分为5 型。位于染色体5q11.2-q13.3区域的运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1，SMN1)的纯合缺失或者复合杂合突变均使得SMN蛋白表达水平下降而导致SMA的发生。SMN1基因存在与其高度同源的SMN2 基因，SMN2在外显子7的一个碱基差异(c.840CT)导致了前体mRNA的选择性剪接的改变，使大多数 SMN2转录产物跳跃了外显子7，产生截断的不稳定的SMN蛋白质(称为SMNΔ7)，但仍有10％的SMN2 基因表达全长转录本，产生少量的有功能的SMN蛋白。因此SMN2是SMA的表型修饰基因，其拷贝数的多少与疾病的严重程度呈负相关，修正SMN2的剪接或提升SMN2表达水平是目前SMA的治疗策略。

甲基-CPG DNA结合蛋白2(MeCP2)可以识别甲基化的DNA，招募转录共同抑制子组成转录抑制复合物以沉默基因的表达。我们前期研究发现：SMN2基因的表达还受到其启动子区的甲基化水平的表观调控作用。 SMN2基因转录活性与启动子区甲基化水平呈负相关。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)是人工合成的单链核酸链，长度在8～50个核苷酸之间，通过标准Watson-Crick碱基配对原则与靶基因mRNA 结合，从而干扰靶基因的表达。反义寡核苷酸药物具有特异性高、药效高、毒副作用低等特点，随着化学修饰的改进，其与靶基因的杂交亲和力增强，也获得了更高的稳定性。近年来ASO技术的进步，通过脊髓腔注射可以使ASO在神经系统中广泛分布，并且在治疗神经退行性疾病(肌萎缩侧索硬化症、SMA、杜氏肌营养不良症等)中取得突破性进展。寻找新的有效的反义寡核苷酸靶标，对于开发新的SMA治疗方案非常有益。本次研究也沿用了反义寡核苷酸可以通过特异性与靶基因结合干扰靶基因的表达特点，针对SMN2 启动子区的MeCP2富集的关键甲基化区域(-167～-43)设计了靶向性结合的ASO(ASO-AP2)。