[发明专利]一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法

说明书

本发明涉及生物技术领域的方法及试剂盒，具体而言，具体为一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法，特别适用于微量样本的二代测序应用；所述试剂盒包括：酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；所述第二酶液为T4 DNA连接酶；所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，所述第二缓冲液由浓度为0.1‑0.6M的Tris‑HCl、浓度为0.05‑0.1M的MgCl2、浓度为0.01‑0.05M的DTT、浓度为1‑10mM的ATP、浓度为30％‑50％的PEG6000和浓度为10‑20％的1,2丙二醇混合而成；接头、index序列和通用引物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域的方法及试剂盒，具体而言，具体为一 种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法。

背景技术

高通量测序技术，在有些文献中称其为下一代测序技术(Next generationSequencing，NGS)，是对传统测序(Sanger测序)一次划时代 的革命性的改变，一次测序可对几十万到几百万条DNA分子序列进 行测定。

近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序， 全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提 供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于样本较少获取难度大， 或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因组DNA少 (低于50ng)。

ctDNA由于携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅 存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞 DNA中出现，相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。 此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地 监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。

因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点， 具有广泛前景。虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但血液中游离 DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA， 按照每个单体型基因组DNA为3.3pg计算。一共只有3000个左右的 基因组分子。而肿瘤的ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有 0.1％-10％。

对于这些微量DNA样本，高建库转化效率是提高测序检测中对 低频变异分析效率的关键参数之一。文库转化率也就是原始DNA分 子数与两端连上接头的分子数比例。这也是建库试剂盒最核心的性能 表现。对于后续靶向捕获或生物信息分析都是非常重要的。更高的文 库转化率带来更高的库容，也就是文库分子多样性，无论对于提高样 本检测的灵敏度还是配合分子标签法提高检测的特异性都是首要条 件。针对微量DNA样本(＜50ng)，目前常用的国内外商品化的建库试 剂盒的建库转化效率偏低，如其中行业口碑很好，也是应用最广泛的 罗氏KAPA Biosystems的KAPA Hyper系列建库试剂盒官方说明书上文 库转化率为5-40％，还不能满足很多应用场景。因此，仍需要对现有 技术进行改进，以改善现有的微量起始样本建库转化率较低的缺陷。

发明内容

针对背景技术中提到的问题，本发明提供一种提高文库转化率的 二代测序建库试剂盒及其方法，特别适用于微量样本的二代测序应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种提 高文库转化率的二代测序建库试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；

所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow 片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；

所述第二酶液为T4 DNA连接酶；

所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；