[发明专利]一种组织工程化周围神经组织及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程化周围神经组织的制备方法，其特征在于：将种子细胞分离和培养、纯化和扩增后，体外诱导种子细胞分化成雪旺细胞，然后制备干细胞聚合体，再将干细胞聚合体植入丝素蛋白导管支架材料，形成组织工程化周围神经组织。

2.根据权利要求1所述的一种组织工程化周围神经组织的制备方法，其特征在于：所述种子细胞包括去分化脂肪细胞、脂肪干细胞或骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的一种组织工程化周围神经组织的制备方法，其特征在于：所述去分化脂肪细胞的分离和培养、纯化和扩增的步骤如下：

a.自口腔颊脂垫、大腿或腹部皮下脂肪组织处抽取脂肪组织，放入含青、链霉素50-150U/mL的PBS于培养皿中浸泡、清洗3次，每次3-5min，将脂肪组织剪碎至1-3mm³，加入脂肪组织2-4倍体积的0.1-0.4% I型胶原酶，震荡，37℃消化0.5-1.5h，加干细胞培养基终止消化；用200μm、100μm滤网依次过滤，离心后收集上层脂肪细胞；PBS洗3次，离心后弃上清液，加干细胞培养基重悬，并接种于培养瓶中，再加满干细胞培养基，培养瓶翻转180°，置于5%CO₂、37℃孵箱内，7天后去培养基，PBS洗2次，加干细胞培养基并翻转180°培养瓶培养，每2-3天换液一次，待细胞生长达60-80%时传代，并标记第一代去分化脂肪细胞；

b.取第一代去分化脂肪细胞以100~200个/mL的细胞密度接种，置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到60%~80%时传代，标记筛选后的种子细胞。

4.根据权利要求2所述的一种组织工程化周围神经组织的制备方法，其特征在于：所述脂肪干细胞的分离和培养、纯化和扩增的步骤如下：

a.自口腔颊脂垫、大腿或腹部皮下脂肪组织处抽取脂肪组织，放入含青、链霉素50-150U/mL的PBS于培养皿中浸泡、清洗3次，每次3-5min，将脂肪组织剪碎至1-3mm³，加入脂肪组织2-4倍体积的0.1-0.4% I型胶原酶，震荡，37℃消化0.5-1.5h，加干细胞培养基终止消化；用200μm、100μm滤网依次过滤，离心收集下层基质血管细胞混合物，PBS重悬，70μm滤网过滤，离心后弃上清液，加干细胞培养基重悬，接种于培养瓶中，并置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每2-3天换液一次，待细胞生长达60-80%时传代，并标记第一代脂肪干细胞；

b. 取第一代脂肪干细胞以100~200个/mL的细胞密度接种，置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到60%~80%时传代，标记筛选后的种子细胞。

5.根据权利要求2所述的一种组织工程化周围神经组织的制备方法，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞的分离和培养、纯化和扩增的步骤如下：

a.自髂骨处抽取骨髓，加入到含800~1200 U/mL肝素钠的生理盐水中，摇晃后再加入1~1.2 g/mL的淋巴细胞分离液，离心后移除单核细胞白色膜状层，PBS洗涤，再离心后弃上清，加入干细胞培养基重悬，置于5%CO₂、37℃条件下进行培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到75%~85%时传代，标记第一代骨髓间充质干细胞；

b.取第一代骨髓间充质干细胞以100~200个/mL的细胞密度接种，置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到60%~80%时传代，标记筛选后的种子细胞。