[发明专利]一种人体细胞外基质培育用筛选方法

权利要求书

1.一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、筛选浓度确定：取对数生长期的细胞，用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×10⁵个/mL的细胞悬液，然后向95孔培养板中加细胞悬液，每孔控制在90～110μL，然后向每孔加入新鲜无抗无血清的培养基60～80μL，接着使其静置24h，24h后，用嘌呤霉素浓度为0μg/ml和6μg/ml以及10μg/ml的新鲜无抗无血清培养基溶液替换培养板各孔中的旧培养基，使细胞进行生存，生存后，嘌呤霉素在3～5天内杀死所有细胞浓度的为最优浓度培养基；

S2、细胞种植：确定最优浓度培养基后，向60mm的培养皿中种植细胞，种植完成后，将其放入到CO2孵箱中进行培养，直到培养皿中的浓度达到70～80％为止；

S3、转染细胞：准备3～5ml无抗生素无血清培养基，向培养基中加入Polybrene溶液，接着向培养基中加入病毒颗粒0.4～0.6ml，然后摇晃培养基，使其混匀，混匀后，去除60mm培养皿内旧的培养基，然后再加入含有病毒的培养基，之后使其静置24～36h；

S4、培养基培育：60mm的培养皿静置24～36h后，换用含最优浓度puromycin的培养基，之后每隔1～2天还换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，接着按照此方法持续15～18天，使抗性群落能被识别出；

S5、细胞传代：将长满后的抗性细胞转入70％到10cm的培养皿中，剩余30％的细胞继续留在60mm的培养皿中，60mm的培养皿内细胞长满后，进行收获细胞，10mm的培养皿内细胞长满后进行传代，传代时间为30～40天；

S6、细胞筛选：传代完毕后，将10mm中的培养液去掉，然后向其加入步骤S1中最优浓度培养基，并且每3～5天更换一次筛选培养基，使其筛选10～14天，使细胞转入到48孔的培养板中增殖，并且加入10μl/孔的细胞悬液，细胞扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在，最终完成筛选工作。

2.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，每天对细胞的活力进行检查，并且每隔2～3天更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基一次。

3.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，细胞生存时间为7～8天。

4.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S3中，向培养基中加入Polybrene溶液时，直到培养基中的浓度达到6～9μg/ml后停止添加Polybrene溶液。

5.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S4中，设立一个对照皿，对照皿中不加入病毒液，然后向对照皿中加入Polybrene溶液，直至对照皿中的浓度达到6～9μg/ml为止。

6.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S5中，收获细胞后，用mRNA的技术对细胞进行鉴定基因类型。

7.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S5中，细胞冻存的时间为8～12天。

8.根据权利要求1所述的一种人体细胞外基质培育用筛选方法，其特征在于：所述步骤S5中，转染后细胞增加至67～73％时，使其按照1:4的密度进行传代，传代后的细胞浓度达到50～70％时开始筛选。