[发明专利]一种人体细胞外基质培育用筛选方法

说明书

本发明公开了一种人体细胞外基质培育用筛选方法，包括筛选浓度确定、细胞种植、转染细胞、培养基培育、细胞传代、细胞筛选，用嘌呤霉素浓度为0μg/ml和6μg/ml以及10μg/ml的新鲜无抗无血清培养基溶液替换培养板各孔中的旧培养基，使细胞进行生存，生存后，嘌呤霉素在5天内杀死所有细胞浓度的为最优浓度培养基。本发明涉及细胞外基质培育技术领域，该人体细胞外基质培育用筛选方法，通过利用转染的方式，使细胞产生抗体，同时不断的转换培养基，用最优浓度培养基进行培育，提高细胞的培育的质量，然后再使细胞进行传代增值，之后提取RNA做RT‑PCR检测，提高细胞的筛选效果，进而对细胞外基质的基因进行相关的研究时，能够提高其研究的精确度。

技术领域

本发明涉及细胞外基质培育技术领域，具体为一种人体细胞外基质培育用筛选方法。

背景技术

细胞外基质是细胞外大分子(如胶原蛋白、酶和糖蛋白)组成的三维网络，为周围细胞提供结构和生化支持，因为在不同的多细胞谱系中，其多细胞化特性是独立进化的，因此，细胞外基质的组成在不同的多细胞结构之间有所不同；然而，细胞粘附、细胞间通讯和分化是细胞外基质的共同功能。

但是目前在对细胞外基质进行培育研究时，对于细胞的筛选效果不理想，从而在对细胞外基质的基因研究时，会影响其研究的精确度，没有对此缺陷进行相应的改进。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人体细胞外基质培育用筛选方法，解决了目前在对细胞外基质进行培育研究时，对于细胞的筛选效果不理想，从而在对细胞外基质的基因研究时，会影响其研究的精确度的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种人体细胞外基质培育用筛选方法，包括以下步骤：

S1、筛选浓度确定：取对数生长期的细胞，用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×10⁵个/mL的细胞悬液，然后向95孔培养板中加细胞悬液，每孔控制在90～110μL，然后向每孔加入新鲜无抗无血清的培养基60～80μL，接着使其静置24h，24h后，用嘌呤霉素浓度为0μg/ml和6μg/ml以及10μg/ml的新鲜无抗无血清培养基溶液替换培养板各孔中的旧培养基，使细胞进行生存，生存后，嘌呤霉素在3～5天内杀死所有细胞浓度的为最优浓度培养基；

S2、细胞种植：确定最优浓度培养基后，向60mm的培养皿中种植细胞，种植完成后，将其放入到CO2孵箱中进行培养，直到培养皿中的浓度达到70～80％为止；

S3、转染细胞：准备3～5ml无抗生素无血清培养基，向培养基中加入Polybrene溶液，接着向培养基中加入病毒颗粒0.4～0.6ml，然后摇晃培养基，使其混匀，混匀后，去除60mm培养皿内旧的培养基，然后再加入含有病毒的培养基，之后使其静置24～36h；

S4、培养基培育：60mm的培养皿静置24～36h后，换用含最优浓度puromycin的培养基，之后每隔1～2天还换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，接着按照此方法持续15～18天，使抗性群落能被识别出；

S5、细胞传代：将长满后的抗性细胞转入70％到10cm的培养皿中，剩余30％的细胞继续留在60mm的培养皿中，60mm的培养皿内细胞长满后，进行收获细胞，10mm的培养皿内细胞长满后进行传代，传代时间为30～40天；

S6、细胞筛选：传代完毕后，将10mm中的培养液去掉，然后向其加入步骤S1中最优浓度培养基，并且每3～5天更换一次筛选培养基，使其筛选10～14天，使细胞转入到48孔的培养板中增殖，并且加入10μl/孔的细胞悬液，细胞扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在，最终完成筛选工作。

优选的，所述步骤S1中，每天对细胞的活力进行检查，并且每隔2～3天更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基一次。

优选的，所述步骤S1中，细胞生存时间为7～8天。