[发明专利]一株重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用，所述重组酿酒酵母的Gis4基因失活。所述的重组酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显增强，在固定化发酵中形成的生物被膜增多，增加了生物产量，缩短了发酵周期，提高了发酵效率。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株敲除Gis4基因的重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与在促进生物膜形成中的应用。

背景技术

生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，这些都是由生物膜的结构决定的。生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株敲除Gis4基因的重组酿酒酵母基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组酿酒酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。

发明思路：Gis4是建立对酿酒酵母中Na+和Li+离子的耐受性的系统的新组成部分。通过参与编码关键Na+/Li+出口泵的ENA1基因的转录调控，在获得耐盐性中发挥其功能。因此，本发明选取Gis4基因作为改造对象，构建重组酿酒酵母基因工程菌，以提高固定化发酵中生物被膜量，进而提高发酵效率和发酵能力

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株重组酿酒酵母基因工程菌，所述重组酿酒酵母的Gis4基因失活。

其中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

其中，所述Gis4基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Gis4基因失活前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增得到Gis4基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PUG6为模板，扩增得到抗性G418目的片段；

(2)以步骤(1)得到的Gis4基因的上游同源臂、下游同源臂和抗性G418目的片段为模板，通过重叠PCR扩增，得到基因敲除片段；

(3)将步骤(2)得到的基因敲除片段转化至酿酒酵母感受态中，即得重组酿酒酵母基因工程菌。

步骤(1)中，扩增Gis4基因上游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

步骤(1)中，所述Gis4基因上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

步骤(1)中，扩增Gis4基因下游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。

步骤(1)中，所述Gis4基因下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

步骤(1)中，扩增抗性G418目的片段引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。