[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，包括从胎盘上剥离羊膜层、清洗、剪碎和消化，其特征在于：还包括从胎盘上剥离羊膜层后，除去基底膜下的基质组织使分离的羊膜尽可能的薄和除去血细胞，然后再进行剪碎和消化；其中胎盘组织为新鲜的足月顺产胎儿的胎盘组织，且胎盘组织经过消毒、清洗后即在无菌条件下，从胎盘上分离羊膜层；且人羊膜不需要先进行上皮细胞的消化分离，而是直接用于消化分离人羊膜间充质干细胞。

2.权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，步骤如下：

(1)取胎盘组织，清洗；

(2)从胎盘上分离羊膜层，

(3)除去基底膜下的基质组织，使分离的羊膜尽可能的薄；

(4)除去血细胞；

(5)将步骤(4)得到的羊膜加工成小碎块；

(6)对羊膜进行消化；

(7)收集细胞滤液，离心，弃掉上清液，收集沉淀；沉淀重悬，再次离心，弃掉上清液；沉淀加入完全培养基重悬，计数，将细胞接种于培养基中，进行培养；

(8)培养一定时间后换液，然后间隔固定时间换液一次，当细胞融合度打到80％之后按照1:3比例传代培养，即得分离纯化的人羊膜间充质干细胞。

3.权利要求2所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：优选用75％酒精或者加了5％双抗的PBS消毒并清洗胎盘组织表面。

4.权利要求3所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(2)在无菌条件下进行；优选羊膜层从胎盘上钝性分离下来；优选用无菌棉拭子除去基底膜下的基质组织。

5.权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(4)中，除去血细胞的方法为：将羊膜置于培养皿，培养皿中装有1/2体积的含有1％双抗的PBS，将羊膜至于培养皿中漂洗并更换培养皿以除去血细胞。

6.权利要求5所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(5)中，小碎块的直径为1-3mm。

7.权利要求6所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(6)中，消化的具体操作为：将羊膜小碎块转移至离心管，将羊膜小碎块与胰酶消化液与胶原酶II消化液混匀置于恒温摇床内振荡；然后终止消化，混匀，过细胞筛，收集过滤液；并将未消化的羊膜继续加入消化液消化，如此重复直至羊膜组织基本被消化完。

8.权利要求7所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(6)中，按质量百分比计，胰酶消化液由0.25％胰酶+0.02％EDTA组成；优选胶原酶II消化液质量百分比浓度为0.1％；优选按照体积比，羊膜小碎块、胰酶消化液、胶原酶II消化液按照1:1:1混合。

9.权利要求8所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(6)中，恒温摇床内温度为37℃，转速为250r/min，振荡时间10～20min；优选终止消化通过加入10％FBS的低糖DMEM/F12培养基实现；优选细胞筛为200目。

10.权利要求9所述的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤(7)中，第一次离心转速为2000r/min，后续离心转速为1500r/min；优选第二次重悬时，加入的完全培养基为含10％FBS的低糖DMEM/F12培养基。