[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明提供一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，包括从胎盘上剥离羊膜层、清洗、剪碎和消化，其特征在于：还包括从胎盘上剥离羊膜层后，除去基底膜下的基质组织使分离的羊膜尽可能的薄和除去血细胞，然后再进行剪碎和消化；其中胎盘组织为新鲜的足月顺产胎儿的胎盘组织，且胎盘组织经过消毒、清洗后即在无菌条件下，从胎盘上分离羊膜层；且人羊膜不需要先进行上皮细胞的消化分离，而是直接用于消化分离人羊膜间充质干细胞。采用本发明的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法分离得到的人羊膜间充质干细胞纯度高、活力强、增值快。结论建立了人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法。hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征。

技术领域

本发明属于细胞分离培养领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术

人羊膜来源干细胞具有多向分化潜能，且因其易于获得、不引起伦理学争议、干细胞含量丰富、免疫原性低等特点，有潜力成为未来再生医学临床应用的重要种子细胞来源。

近年来的研究证明,人羊膜间充质干细胞(hum-an amniotic mesenchymal stemcells,hAMSCs)具有与骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchy-mal stemcells,BMSCs)相似的表型谱，具有多谱系分化潜能，可分化为三个胚层不同类型的细胞，而且其扩增能力强于BMSCs[1～8],同时具有来源广泛，不牵涉医学伦理问题等优势，因此，hAMSCs作为再生医学(regenerative medicine)的细胞资源已颇受关注。但是目前关于hAMSCs的分离、培养及鉴定尚无推荐的标准化方案,因此建立其高丰度、高纯度、高活力的分离方法、简便而明确的鉴定指标和适宜的体外传代培养方案十分必要。

公开号为CN106244521A的中国发明专利是申请公开了一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途。所述方法包括如下步骤：(1)将羊膜从胎盘组织上剥离后清洗；(2)将清洗后的羊膜剪碎，并用胰酶消化处理；(3)将消化处理后得到的消化液过筛后，收集细胞滤液，并离心处理；(4)将离心处理得到的细胞用培养基悬浮后接种，并培养；(5)当培养的细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得人羊膜上皮细胞。本发明方法中，通过将羊膜上皮细胞从胎盘上提取分离并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到羊膜上皮细胞。同时，本发明培养得到的人羊膜上皮细胞纯度高，还能够用于糖尿病等疾病的治疗中，并能够有效控制控制患者的血糖水平。

北京协和医学院的冯小倩的硕士论文《人羊膜上皮细胞的性质研究》公开了人羊膜间充质干细胞的分离：取标本、对标本进行固定、石蜡包埋切片、人羊膜全层的组织学染色、消化分离人羊膜上皮细胞后消化分离人羊膜间充质干细胞。

以上现有技术存在以下缺陷：得到的人羊膜间充质干细胞里杂质比较多，人羊膜间充质干细胞分离纯度低、活力弱、增殖慢。

发明内容

为了解决以上现有技术中的杂质多的技术问题，本发明提供一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，具有人羊膜间充质干细胞纯度高、活力强、增值快的优点。

为了达到以上目的，采用如下技术方案：一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，包括从胎盘上剥离羊膜层、清洗、剪碎和消化，还包括从胎盘上剥离羊膜层后，除去基底膜下的基质组织使分离的羊膜尽可能的薄和除去血细胞，然后再进行剪碎和消化；其中胎盘组织为新鲜的足月顺产胎儿的胎盘组织，且胎盘组织经过消毒、清洗后即在无菌条件下，从胎盘上分离羊膜层；且人羊膜不需要先进行上皮细胞的消化分离，而是直接用于消化分离人羊膜间充质干细胞。

优选的是，所述人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，步骤如下：

(1)取胎盘组织，清洗；

(2)从胎盘上分离羊膜层，

(3)除去基底膜下的基质组织，使分离的羊膜尽可能的薄；