[发明专利]一种重组氧化葡糖杆菌工程菌及其合成米格列醇中间体的应用

说明书

本发明公开了一种重组氧化葡糖杆菌工程菌及其合成米格列醇中间体的应用，所述重组氧化葡糖杆菌工程菌是将透明颤菌血红蛋白基因vhb和山梨醇脱氢酶基因sldAB共同转入宿主菌构建而成；所述宿主菌为氧化葡糖杆菌。本发明中重组氧化葡糖杆菌生长速率及最终山梨醇脱氢酶活力均有提升，利用静息细胞生产6‑脱氧‑6‑氨基(N‑羟乙基)‑α‑L‑呋喃山梨糖显示出了较高的催化能力，单批次在24h内可催化合成96.1g/L的6NSL，相比于专利CN110016455A所构建的G.oxydans/pBBR‑sldAB，同样条件下6NSL的产量提高了9.5％。

(一)技术领域

本发明涉及一种米格列醇中间体的制备，特别涉及一种双基因共表达的重组氧化葡糖杆菌工程菌及其应用，尤其是通过利用静息细胞催化生产米格列醇中间体6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)。

(二)背景技术

米格列醇(Miglitol)是1-脱氧野尻霉素的N-羟乙基衍生物，是一种新型小肠α-葡萄糖苷酶抑制剂，是治疗II型糖尿病的主导药物之一。其化学名1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇；沸点：246.0℃，熔点：-20℃，其分子结构式下：

目前合成米格列醇通常采用生物与化学组合法：以N-羟乙基葡萄糖胺(NHEG)为底物，利用氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)生物催化为6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)，然后通过加氢还原得到米格列醇。该方法具有生产路线短，成本较低等明显优势。

利用G.oxydans催化NHEG为6NSL的反应是米格列醇合成的关键步骤。而催化反应的完成需要两个步骤：第一，在含山梨醇的培养基中培养氧化葡糖杆菌，重点在于提高起催化作用的细胞膜山梨醇脱氢酶的酶活；第二步，用G.oxydans的静息细胞催化NHEG反应生产6NSL，提高该中间体的产率对于降低生产米格列醇的成本很重要。G.oxydans是一种专性需氧革兰氏阴性细菌，可以利用膜结合脱氢酶不完全氧化一系列的醇类或者糖类化合物。这些膜结合脱氢酶的活性中心朝向周质空间，有利于底物的进入周质空间和催化产物的排出而不需要消耗能量。因为其直接与呼吸链相连，所以可以将还原当量直接传递给最终电子受体氧气，而不需要NADH的参与。这种周质不完全氧化系统造成了底物的快速氧化和较低的生物量积累。当G.oxydans在含山梨醇的培养基上生长时，膜结合PQQ依赖性的山梨醇脱氢酶(mSLDH,EC1.1.99.22)在周质空间中将山梨醇不完全氧化成山梨糖，这为细胞生长提供了能量，并造成了G.oxydans菌体培养过程中大量的氧气消耗。同时，山梨醇脱氢酶也负责将NHEG催化合成6NSL，所以催化过程也需要氧气的参与。因此，供氧被认为是影响利用G.oxydans作为催化剂生产6NSL的最重要因素之一。至今为止，为了提高6NSL的产量已经进行了许多工作，如专利US4806650，US5401645，CN108441491A，CN110016455A。其中通过基因工程方法过表达山梨醇脱氢酶合成基因sldAB是一种提升NHEG转化效率高效的方式(CN110016455A)。但胞内关键酶表达水平的提高进一步提高了氧气的消耗，因此提高基因重组菌菌体培养时的氧气供应显得尤为重要。传统的方法例如提高搅拌转速、引入纯氧或者增大发酵罐压力等会导致能量的消耗或者带来安全隐患。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla haemoglobin)可以直接从环境中获取氧气并将其传递给呼吸链末端氧化酶，当其在宿主中外源表达时能够提高细胞自身对氧气的利用效率，并且已经成功应用于一些工业产品的生产中。为了满足氧化葡糖杆菌在培养和催化过程中对氧气的需求以提高氧化底物NHEG的能力，在过表达内源山梨醇脱氢酶的基础上进行外源VHb蛋白的表达。

(三)发明内容